52(4): 89 - 93 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009

1

PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG
(Glycine max (L.) Merill) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

Nguyễn Thị Thuý Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu (Đại học Thái Nguyên)
Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (Viện Công nghệ Sinh học) Tóm tắt

Hai giống đậu tương ĐT12 và ĐT84 đã được sử dụng trong nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro từ đốt lá
mầm. Hạt đậu tương sau khi thu hoạch được nuôi cấy trên môi trường GM: 3052mg/l muối B
5
; 10ml MS IV;
30g/l sucrose; 0,6369 g/l MES, pH 5,8; 6,5g/l agar, vitamin B
5
1X. Sau 3 ngày hạt nảy mầm có màu xanh cắt
bỏ phần trụ rễ, tách đôi lá mầm thành hai mẫu riêng biệt cấy chuyển sang môi trường tạo cảm ứng chồi (môi
trường SIM): 3052mg/l muối B
5
; 10ml MS IV; 30g/l sucrose; 0,6369 g/l MES, pH 5,6; 6,5g/l agar, vitamin B
5

1X; BAP (1mg/l, 1,5mg/l, 1,67mg/l).
Sau 4 tuần cấy chuyển cụm chồi sang môi trường kéo dài chồi (môi trường SEM): 3052mg/l muối B
5
;
10ml MS IV; 30g/l sucrose; 0,6369 g/l MES, pH 5,6, 6,5g/l agar; GA

mang lại hiệu quả cao trong công tác tạo giống đậu
tương với các tính trạng mong muốn (Krishnan,
2005) [2]. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương
đã được thực hiện nhờ vi khuẩn Agrobacterium với
Ti-plasmid qua đốt lá mầm (Chee và cs, 1989;
Donaldson and Simmonds, 2000) [1], [6] hoặc phôi
xoma (Yoichi Kita, 2007) [8]... và cho đến nay
theo thống kê của USDA, diện tích trồng cây đậu
tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ chiếm 81%
ở Mỹ; 99,1% ở Argentina và 34% ở Brazil
(Letster, 2004) [3]. Tuy nhiên, ở Việt Nam, tạo
giống đậu tương mới bằng kỹ thuật chuyển gen
mới chỉ bắt đầu được quan tâm nghiên cứu.
Đậu tương là đối tượng thực vật rất khó thực
hiện nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo mô
sẹo, tái sinh cây, tạo rễ và ra cây. Tái sinh in vitro
ở cây đậu tương có thể được thực hiện từ phôi
xoma, phôi non và đốt lá mầm [1], [6], [8]. Kỹ
thuật tái sinh từ đốt lá mầm có ưu điểm về khả
năng tái sinh và cho ra chồi cao, thời gian từ khi
bắt đầu cho đến khi ra cây được rút ngắn đáng kể
còn khoảng 3 tháng (Olhoft và cs, 2003) [5].
Thành công của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực
vật phụ thuộc nhiều vào sự lựa chọn môi trường
dinh dưỡng, tỷ lệ các chất điều hoà sinh trưởng và
52(4): 82 - 88 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009
2

các yếu tố khác. Nhu cầu dinh dưỡng cho sinh
trưởng tối ưu ở các loài và giữa các bộ phận cơ thể

0
C ± 1
0
C.
2.Phƣơng pháp nghiên cứu
Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro : hạt của các
giống đậu tương thu nhập được gieo trồng . Theo
dõi thời gian sinh trưởng, ra hoa kết quả của các
giống, khi hạt chín thu cắt quả chín (qua các thí
nghiệm chúng tôi nhận thấy các hạt khi vừa đến lúc
thu hoạch làm thí nghiệm cho tỷ lệ nảy mầm là
100%).
Khử trùng hạt: Bóc vỏ, chọn những hạt to, mẩy
không bị nứt vỏ đem tráng nước vô trùng hai lần
sau đó rửa cồn trong vòng 1 phút, làm lại hai lần,
sau đó tráng sạch hạt bằng nước vô trùng, lắc hạt
với dung dịch Javen trong vòng 20 phút, đảo, lắc
thật đều, tráng sạch hạt bằng nước vô trùng nhiều
lần (thí nghiệm với nồng độ cồn và Javen khác
nhau, thời gian khử trùng khác nhau).
Môi trường nảy mầm hạt (GM): Ngâm hạt trong
nước cất 2 giờ sau đó cấy vào bình tam giác trong
môi trường GM : Muối B5 + 30g/l sucrose + 6,5g/l
aga, PH = 5,8. Khảo sát khả năng nảy mầm hạt sau
0, 1, 2, 3, 4, 5 ngày. Sau thời gian khoảng 2-3 ngày
khi hạt đã nảy mầm chuyển sang mầu xanh theo
dõi tỷ lệ nảy mầm.
Môi trường cảm ứng tạo đa chồi: Sau khi hạt nảy
mầm dùng dao giải phẫu cắt bỏ phần lớn trụ rễ,
chừa lại khoảng 3-5 mm cách từ nốt lá mầm xuống,

(RM) gồm có: 1,58g/l : MS; 20g/l sucrose; 0,59g/l
MES; 1mg/l: IBA; pH = 5,6; agar: 6,5 g/l +
Vitamin B5 : 1X.
Tái sinh cây hoàn chỉnh: Cây tái sinh hoàn chỉnh
được ra bầu và đưa ra trồng ở nhà lưới.
52(4): 82 - 88 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009
3

Bảng 1. Thành phần các môi trường nuôi cấy dùng cho tái sinh cây từ đốt lá mầm
Loại môi trường Ký hiệu Thành phần cơ bản
Cảm ứng tạo chồi GM
3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, pH5.8; 6,5g/l agar
+ vitamin B5 1X
Cảm ứng tạo đa chồi
SIM 1
3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, 0,6369 g/l MES,
pH5.6; 6,5g/l agar + 1mg/l BAP + vitamin B5 1X
SIM 1,5
3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, 0,6369 g/l MES,
pH5.6; 6,5g/l agar + 1,5 mg/l BAP + vitamin B5
SIM 1,67

Hạt đã khử trùng ngâm trong nước cất hai tiếng
sau đó cấy trên môi trường GM. Ở giai đoạn nảy
mầm, hạt chủ yếu sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn
trong hạt nên môi trường chỉ cần cung cấp những
chất cơ bản và chưa cần cung cấp nhóm kích thích
sinh trưởng. Ở cả hai giống ĐT12 và ĐT84 đều sau
1 ngày hạt bắt đầu nứt vỏ và sau 3 ngày hạt nảy
mầm hoàn chỉnh và bắt đầu chuyển sang màu xanh,
tỷ lệ nảy mầm đạt 98% – 100%.
3. Môi trƣờng cảm ứng tạo chồi
Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo
cảm ứng chồi
Giai đoạn cảm ứng tạo chồi là giai đoạn quan
trọng trong quá trình phát triển chồi từ nách lá
mầm. Môi trường cảm ứng tạo chồi ở đa số các loài
thực vật cần sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng
thuộc nhóm auxin và xytokinin như IAA, IBA,
BAP...Trong đó BAP thuộc nhóm kích thích sinh
trưởng xytokinin được sử dụng phổ biến để tạo
cảm ứng chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau. Vì
việc sử dụng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng
thích hợp có ý nghĩa
quan trọng đối với từng giai đoạn phát triển của
cây. Đây là nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế
bào (Vũ Văn Vụ, 1999) [7].
Khả năng tạo cảm ứng chồi và số lượng chồi/
một mảnh lá mầm là những thông số dùng để đánh
giá tính thích ứng của giống trong hệ thống nuôi
cấy in vitro nhằm sử dụng cho mục đích chuyển
gen sau này. Kết quả ở bảng 2 cho thấy khả năng

(mg/l)
Mẫu TN
Số mảnh cấy
Tỷ lệ tạo chồi
sau 2 tuần
Tỷ lệ tạo chồi
sau 4 tuần
Số chồi TB/ 1
mảnh lá
Chất lượng
chồi

ĐT12
1.0 100 17,5 19,8 1,1 -
1.5 100 89,5 91,2 2,3 +
1.67 100 35,7 30,5 1,2 -

ĐT84
1.0 100 19,7 18,6 1,2 -
1.5 100 91,6 92,1 2,2 +
1.67 100 27,9 23,8 1,3 -
Ghi chú: Chất lượng chồi: (-) : Chồi yếu, có màu vàng hoặc trắng; (+): Chồi khỏe, có màu xanh
A B
Hình 2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo cảm ứng chồi (A: Giống ĐT12, B: Giống ĐT84)

Số chồi/ mẫu 1 2 3 4 Số chồi TB/
mẫu
1 2 3 4 Số chồi TB/ Mẫu
Không thương tổn
(200 mẫu)
188 12 0 0 1,06 192 8 0 0 1,04
Thương tổn
(200 mẫu)
6 145 30 19 2,31 11 153 28 8 2,18
A B C D E F
Hình 4. Các mẫu ĐT84 sau khi gây thương tổn tạo chồi (A, B, C, D, E) và không gây thương tổn (F)

Khả năng kéo dài chồi của hai giống đậu tương
ĐT12 và ĐT 84
Sau khoảng thời gian 2 tuần khi chồi được hình
thành cấy chuyển sang môi trường SEM có bổ sung
các chất dinh dưỡng khác nhau tạo thuận lợi cho sự
phát triển của chồi và chuẩn bị cho cây ra rễ.
Trong đó có bổ sung hai chất kích thích sinh trưởng
đó là GA
3
và IAA, trong đó IAA thuộc nhóm kích
thích sinh trưởng auxin và là dạng auxin chủ yếu và
quan trọng nhất của tất cả các thực vật kể cả thực