Tp chớ Khoa hc v Phỏt trin 2009: Tp 7, s 4: 533 - 542 TRNG I HC NễNG NGHIP H NI

533

XÂY DựNG Hệ THốNG TáI SINH
IN - VITRO
CÂY KHOAI TÂY PHụC Vụ
CHọN TạO GIốNG MớI BằNG Kỹ THUậT CHUYểN GEN V DUNG HợP Tế BO TRầN
Study on Potato In - vitro Regeneration System for
Gene Transfering and Protoplast Fusion
inh Trng Sn, Nguyn Th Phng Tho, Nguyn Th Thanh Phng,
Nguyn Th Thu Thy, Nguyn Quang Thch
Vin Sinh hc Nụng nghip, Trng i hc Nụng nghip H Ni
TểM TT
Nghiờn cu c tin hnh nhm xõy dng qui trỡnh to callus v tỏi sinh cõy cõy khoai tõy.
on thõn v mụ lỏ ca dũng khoai tõy Diamant (2n = 4x) v 3 dũng nh bi A15, H1959/195, H1929/34
(2n = 2x) c nuụi cy trờn mụi trng MS cú b sung cỏc loi ng glucose, sucrose, manitol v
cỏc cht iu tit sinh trng -NAA (0,1 - 0,5 ppm), 2,4-D (0,1 - 0,25 ppm); BA (1 - 3 ppm), Kinetin (0,5
-3 ppm) riờng r nhm kớch thớch quỏ trỡnh cm ng to callus v tỏi sinh chi. Nhỡn chung cm ng
to callus din ra khỏ thun li i vi on thõn v mụ lỏ ca tt c cỏc dũng khoai tõy nghiờn cu
vi t l m
u to callus t khỏ cao t 70 100% i vi ging Diamant v t 21,4 - 97,5% i vi cỏc
ging nh bi. T l to chi cao nht t 78,6% khi nuụi cy on thõn ca ging Diamant trờn mụi
trng MS + 15 g sacaroza + 30 g manitol + 5 g glucoza + 2 mg BA/lớt. Mụi trng ny cng cho t l
tỏi sinh chi t on thõn dũng nh bi H1959/195 cao nht t 52,6%. on thõn cỏc v trớ khỏc
nhau cho t l sng v kh nng tỏi sinh chi khỏc nhau, cao nht t
c vi cỏc on thõn v trớ
gn gc. Sinh trng v phỏt trin ca cỏc cõy tỏi sinh in -vitro trờn ng rung khụng cú s sai khỏc
so vi cõy i chng.
T khoỏ: Diploid, khoai tõy Diamant, tỏi sinh.
SUMMARY

(protoplast)... nhằm tạo ra những giống
khoai tây mới với các đặc tính mong muốn.
Trong đó, việc nghiên cứu xây dựng hệ thống
tái sinh khoai tây đợc nhiều tác giả quan
tâm vì đó l yêu cầu đầu tiên nhng có ý
nghĩa quyết định đến việc thnh công của
các phơng pháp. James and cs. (2000) cho
rằng, các dòng khoai tây khác nhau thì có
khả năng tái sinh rất khác nhau. Các nghiên
cứu chọn giống khoai tây có khả năng chống
chịu virus nhờ dung hợp tế bo trần của
Nguyễn Quang Thạch, Frei, Wenzel (1993)
cho thấy, protoplast đã hình thnh các mô
sẹo v sau đó đợc chuyển sang môi trờng
tái sinh, tạo rễ v hình thnh cây hon
chỉnh.
Mục đích của nghiên cứu ny nhằm tiến
hnh xây dựng hệ thống tái sinh cho một số
dòng khoai tây nhập nội, tạo cơ sở cho kỹ
thuật chuyển gen v dung hợp tế bo trần
trong tạo giống khoai mới với năng suất chất
lợng cao.
2. VậT LIệU V PHƯƠNG PHáP
NGHIÊN CứU
2.1. Nguyên liệu
Giống khoai tây nuôi cây mô Diamant
v 3 dòng khoai tây nhị bội - diploid (A
15
,
H

Các thí nghiệm đa cây in-vitro ra ngoi
vờn ơm: Các cây đạt tiêu chuẩn (cây cao
trên 3,5 cm, có từ 4 - 5 rễ trở lên, rễ di
khoảng 2,5 - 3,0 cm) đợc trồng địa canh.
Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc
lại trồng 40 cây (hng cách hng v cây cách
cây 5 cm).
2.2.2. Phơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đợc xử lý thống kê sinh học theo
chơng trình IRRISTAT 4.0 v Microsoft
Excel.
3. KếT QUả NGHIÊN CứU V THảO
LUậN
3.1. Nghiên cứu tái sinh giống khoai tây
Diamant (2n = 4x)
3.1.1. ảnh hởng của nền môi trờng đến
khả năng phát sinh hình thái của
mô nuôi cấy
Các yếu tố của môi trờng nuôi cấy, điều
kiện nuôi cấy có ảnh hởng trực tiếp đến
khả năng tái sinh của cây (Robert v cs.,
1980) (Bảng 1).
inh Trng Sn, Nguyn Th Phng Tho, Nguyn Th Thanh Phng...
535

Bảng 1. ảnh hởng của nền môi trờng đến khả năng phát sinh hình thái
của mô nuôi cấy (sau 8 tuần nuôi cấy)
ng hng tỏi sinh ca mu cy
CT Loi mụ
T l mu sng

của mẫu cấy đạt rất cao v đều đạt 100%
trên các công thức môi trờng. Đờng
manitol v glucoza tỏ ra có tác động kích
thích rất mạnh đến khả năng phát sinh hình
thái tạo callus của mẫu cấy. Công thức 1 chỉ
bổ sung 30 g sacaroza không hề có sự tái
sinh tạo callus trên cả 2 loại mẫu cấy (lá,
đoạn thân) trong khi đó ở công thức 2 bổ
sung 15 g sacaroza + 30 g manitol + 5 g
glucoza/lít cho tỷ lệ tạo callus đều đạt 100%
trên cả 2 loại mẫu cấy. Mặc dù, mẫu cấy
cha có hiện tợng tái sinh tạo chồi nhng
nền môi trờng MS + 15 g sacaroza + 30 g
manitol + 5 g glucoza/lít (MS2), sẽ đợc sử
dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. ảnh hởng của các chất điều tiết
sinh trởng đến khả năng phát sinh
hình thái của mô nuôi cấy giống
khoai tây Diamant
Để điều khiển sự phát sinh hình thái
của mô nuôi cấy, ngời ta bổ sung vo môi
trờng nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh
trởng thực vật l auxin v cytokinin. Tỷ lệ
hm lợng hai nhóm chất ny trong môi
trờng khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh
hình thái khác khác nhau (Nguyễn Quang
Thạch v cs., 2005). Trong nghiên cứu, các
chất điều tiết sinh trởng BA, 2,4D, Kinetin,
NAA v một số tổ hợp đã đợc sử dụng
(Bảng 2).

ng hng phỏt sinh hỡnh thỏi
Cụng thc
Loi
mụ
T l
sng
(%)
To callus (%) To r (%) To chi (%)
Hỡnh thỏi mụ
nuụi cy
Lỏ 100 100 3,3 0
CT1 (MS2) (i chng)

Thõn 100 100 0 0
Cú xut hin
callus nh hai
u vt ct.
Lỏ 100 100 7,3 0
CT2 (MS2 + 0,10 mg 2,4-D/l)
Thõn 100 100 20,6 0
Lỏ 93,3 93,3 10,0 0
CT3 (MS2 + 0,15 mg 2,4-D/l)

Thõn 100 100 38,8 0
Lỏ 78,0 78,0 12,7 0
CT4 (MS2 + 0,20 mg 2,4-D/l)

Thõn 100 100 25,0 0
Lỏ 70,0 70,0 30,0 0
CT5 (MS2 + 0,25 mg 2,4-D/l)

Thõn 100 100 0 0
Lỏ 98,6 98,6 0 0
CT2 (MS2 + 0,5 mgBA/l)
Thõn 100 100 0 20,3
Lỏ 96,2 96,2 0 0
CT3 (MS2 + 1,0 mgBA/l)
Thõn 100 100 0 45,8
Lỏ 92,8 92,8 0 0
CT4 (MS2 + 1,5 mgBA/l)
Thõn 100 100 0 60,1
Lỏ 88,6 88,6 0 0
CT5 (MS2 + 2,0 mgBA/l)
Thõn 100 100 0 78,6
Lỏ 82,3 82,3 0 0
CT6 (MS2 + 2,5 mgBA/l)
Thõn 100 100 0 75,3
Lỏ 75,2 75,2 0 0
CT7 (MS2 + 3,0 mgBA/l)
Thõn 100 100 0 70,7
- Sau 20 ngy nuụi
cy, t on mụ thõn
xut hiờn chi.
- Cỏc mụ lỏ khụng cú
kh nng tỏi sinh to
chi.
- Mụ t s tỏi sinh to
chi: ban u, mu
cy to callus v
phỡnh nh hai u
ca on thõn. Khi soi

Loi
mụ
T l sng
(%)
To callus
(%)
To r
(%)
To chi
(%)
Chiu cao chi
(cm/cõy)
S lỏ
(lỏ/cõy)
Lỏ 100 100 3,3 0 0 0
CT1 (MS2) (i chng)
Thõn 100 100 0 0 0 0
Lỏ 100 100 0 0 0 0
CT2 (MS2 + 0,5 mg kinetin/l)
Thõn 100 100 0 10,0 0,1 1c
Lỏ 100 100 0 0 0 0
CT3 (MS2 + 1,0 mg kinetin/l)
Thõn 100 100 0 12,3 0,2 1c
Lỏ 93,0 93,0 0 0 0 0
CT4 (MS2 + 1,5 mg kinetin/l)
Thõn 100 100 0 14,7 0,4 2b
Lỏ 90,0 90,0 0 0 0 0
CT5 (MS2 + 2,0 mg kinetin/l)
Thõn 100 100 0 16,0 0,4 2b
Lỏ 86,0 86,0 0 0 0 0

những thế hệ đầu tiên sinh trởng chậm v
có hiện tợng phân nhánh (số nhánh đạt 1,3,
0,9 v 0,2/cây).
Nhìn chung, cây tái sinh từ thế hệ thứ 4
trở đi đã có các chỉ tiêu sinh trởng v khả
năng tạo củ l tơng tự nhau v khá ổn định
(thế hệ 4, thế hệ 5) khi so sánh với cây đối
chứng.
Thí nghiệm cho thấy, cây tái sinh có khả
năng sinh trởng v phát triển tơng đơng
nh cây đối chứng. Hầu hết các chỉ tiêu theo
dõi chỉ biến động nhẹ. Qua đó cho thấy, cây
tái sinh hon ton không có biến đổi về mặt
hình thái so với cây không qua tái sinh khi
tiến hnh theo dõi ngoi đồng (Hình 3, 4).