ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐINH THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH
VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS CHU HOÀNG MẬU

Thái Nguyên- 2008

1
MU
1. Lý do chn  tài
u tng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghip ngn ngày, có giá
tr kinh t và hàm lng dinh dng cao. Ht u tng cha 30 % - 56% protein,
cha nhiu loi axit amin không thay th (lysin, tryptophan, metionin, cystein,
leucin…), 12 %-25% lipit, và các vitamin (B1, B2, C,D, E, K…) cn thit cho c
th ngi và ng vt. Mt c tính quan trng na ca cây u tng là có nt sn
 r to kh nng cnh nit không khí, vì vy trng u tng góp phn ci to
t và bo v môi trng [20].
Sn xut u tng phát trin mnh ti M, Brazil, Argentina, Trung Quc và
nhiu nc khác. Sn lng u tng trên th gii t hàng trm triu tn/ nm. Trong
khi ó,  Vit Nam sn lng mi cht trm nghìn tn/ nm, u ó chng t tình
hình sn xut u tng  nc ta so vi khu vc vn còn  mc thp.  thúc y sn
xut u tng vn  quan trng là chn to c nhng ging không ch cho nng
sut cao, phm cht tt mà còn phi thích hp vi u kin a hình khí hu.
c ta có h sinh thái rt a dng, khí hu gia các vùng, min li không
ging nhau. a hình có n 3/4 là i núi thng có mùa khô hanh  min Bc, mùa
khô nóng  Tây Nguyên…Nhng nm gn ây din bin khí hu ngày càng phc tp,
ng ma phân b không u gia các vùng và gia các thi k trong nm nên hn

ging u tng trng ti Tây Nguyên.
- Xác nh hàm lng protein, lipit trong ht ca các ging u tng nghiên cu.
- Phân tích thành phn axit amin trong protein ht ca các ging u tng
- Xác nh hàm lng protein tan, hot  ca proteaza  giai n ht ny mm.
-ánh giá kh nng chu hn ca các ging u tng  giai n cây non
trong iu kin hn nhân to.
- Xác nh hàm lng prolin  giai on cây non 3 lá  thi m trc và sau
khi x lý bi hn.
- Nhân, tách dòng và c trình t gen chaperonin liên quan n tính chu hn
ca mt s ging u tng trng ti Tây Nguyên.
3
Chng 1
NG QUAN TÀI LIU
1.1. CÂY U TNG
1.1.1. c m sinh hc ca cây u tng
u tng có tên khoa hc là Glycine max (L) Merrill, có b nhim sc th
2n = 40, thuc thân tho, hu (Fabaceae), h ph cánh bm (Papilionoidea).
u tng có ngun gc t các tnh phía Bc và ông Bc Trung Quc, các vùng
k cn ca Cng hòa liên bang Nga, Triu Tiên và Nht Bn.Các ging u tng
ang trng ti nc ta c du nhp t Trung Quc t lâu i [13].
V hình thái, cây u tng các b phn chính là r, thân, lá, hoa và qu
Ru tng có r cc gm r cái và r bên, trên b r ca cây u tng có
nhiu nt sn cha vi khun Rhizobium japonicum có kh nng cnh nit t khí
tri cung cp m cho cây, có vai trò ci to t [9].
Thân u tng có hình tròn, thân non có màu xanh hoc tím, khi qu chín
thì thân ng sang màu vàng nâu.
Lá u tng gm 3 loi lá: lá mm, lá n và lá kép (có 3 lá chét ôi khi có
4-5 lá chét).
Hoa mc thành chùm  nách lá, mi chùm hoa có t 10-15 hoa, có màu trng
hoc tím, hoa u tng t th phn hoàn toàn. Qu có th thng hoc cong có

2
ca loài vi khun
Rhizobium cng sinh trên r cây. Nh kh nng cnh m nên sau mi v thu
hoch thành phn hóa tính ca t trng c ci thin rõ rt, lng m trong t
tng và khu h vi sinh vt hiu khí trong t ng tng. Do ó, có li i vi cây
trng khác và sau khi thu hoch toàn b thân lá, r, lá ph li b mt t va có tác
dng che ph chng xói mòn, va là ngun hu c giàu m ci to t.
1.1.3. Tình hình sn xut u tng trên th gii và  Vit Nam
Trên th gii (tính n tháng 4/ 2006), có 78 nc trng u tng vi din
tích là 91,3 triu ha; nng sut 22,9 t/ ha, sn lng t 236,1 triu tn. Các nc
sn xut u tng ng u th gii là: M, Brazil, Argentina và Trung Quc
chim khong 90-95% tng sn lng u tng trên toàn th gii [45].
5
Nh vy, có th thy u tng chim mt v trí quan trng trong nn kinh t
th gii không ch do c gieo trng trên din tích ln  78 nc, mà ht u tng
còn c s dng rng rãi  làm thc phm và nguyên liu cho công nghip.
Bng 1.1. Sn lng u tng ca mt s nc trên th gii niên v 2006 – 2007
(Theo Oil World); n v tính: triu tn
 Vit Nam, trong vòng hn 20 nm qua (t 1985- 2006) din tích, nng
sut và sn lng u tng ã không ngng tng, c bit trong nhng nm gn
ây:  th m 2000 din tích trng u tng là 124100 ha n nm 2005 tng lên
203600 ha, nng sut t t 12000 t/ha nm 2000 lên 14,300 t/ha nm 2005 và
sn lng t 147300 tn nm 2000 lên 290600 tn nm 2005 [21].
Th gii 236,1
M 86,8
Brazil 59,0
Argentina 47,2
Paraguay 6,5
Trung Quc 16,2
n  7,7

Vùng ông Bc 48,4 1040 50,2
Vùng Tây Bc 25,0 1150 28,7
Vùng Bc Trung B 6,5 1220 7,9
Tây Nguyên 27,1 1570 42,5
ông Nam B 5,3 1060 5,6
ng bng Sông Cu long 21,2 2100 44,5
ng 3.1 cho thy Tây Nguyên là vùng có din tích trng u tng ln th
3 trong 7 vùng nông nghip trên  c.Cùng vi s ng trng a các loi cây
trng chính nh cao su, cà phê, h tiêu, ca cao….thì cây u tng ng ang c
chú trng và phát trin trên vùng t này.
Mc dù, sn lng u tng  nc ta có tng nhng so vi các nc trên
th gii và trong khu vc nng sut ca ta vn còn thp, và c bit trong nhng
m gn ây din tích, nng sut và sn lng u tng ca nc ta gim i áng
7
k. Nm 2005 din tích t 203600 ha gim xung ch còn 185800 ha nm 2006 và
sn lng gim t 290600 tn nm 2005 xung còn 186900 tn nm 2006.
Nguyên nhân chính là do u t thp, cha có b ging phù hp, cha áp
dng k tht tiên tin. Vì vy, nghiên cu ci tin các c m nông sinh hc ca
các ging a phng và to ging mi có nng sut cao, thích nghi vi u kin
sinh thái  nhng vùng khác nhau bng phng pháp truyn thng kt hp vi hin
i s áp ng c yêu cu ca thc tin t ra và ó cng là chin lc quan
trng v s phát trin cây u  nc ta.
1.1.4. Thành phn hóa sinh ht u tng
Trong ht u tng có các thành phn ã bit tính theo t l protein 30-
56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các mui khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S, các
vitamin A, B1, B2, D, E, F, các men, sáp, nha, cellulose. Ngoài ra, ht u tng
còn có  các axit amin c bn isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin,
tryptophan, valin [20].
Protein là thành phn ch yu trong ht u tng. Chúng chim khong
30%-55% khi lng khô ca ht. Da vào h s lng, ngi ta chia protein ca ht

Thiu nc trc tiên nh hng n s cân bng nc ca cây, tó nh
ng n chc nng sinh lý nh quang hp, hô hp dinh dng khoáng và cui
cùng nh n s sinh trng phát trin ca thc vt. Cây s cht non hoc gim sc
sng, gim nng sut [19].
Hin tng mt nc có th do tác ng s cp, là kt qu ca s thiu nc
trong môi trng, hoc là tác ng th cp c gây ra bi nhit  thp, st
nóng hay tác ng ca mui. Hn cng nh yu t ngoi cnh bt li khác khi tác
ng lên c th thc vt s gây ra phn ng ca c th. Tùy theo tng loài, ging
mà mc  phn ng ca c th cng nh thit hi do khô hn gây ra khác nhau:
mt s b cht, mt s b tn thng nhng cng có mt s khác không b nh
ng. Kh nng thc vt có th gim thiu mc tn thng do thiu ht nc gây
ra gi là tính chu hn [19].
9
Vit Nam là mt nc có a hình a dng và din bin khí hu phc tp, lng
a phân b không u gia các vùng, min và gia các thi k trong nm nên hn
hán có th xy ra  bt k mùa nào, vùng nào. Din tích có ti 3/4 lãnh th là i núi,
t canh tác ca các khu vc này thng xuyên b hn nên thành phn th nhng ca
các vùng khác nhau rt rõ rt. Tt c các yu t trên chi phi mnh m mc nc ngm
và kh nng gi nc ca t.  chng li khô hn cây có th gi không b mt
c, gim din tích lá, rút ngn chu k sng…Kh nng duy trì áp sut thm thu ni
bào có tác dng bo v hoc duy trì sc sng ca t bào cht khi b mt nc [2]. Có
hai loi hn do môi tng tác ng là hn t và hn không khí [1], [5].
Tác ng a n lên cây ch yu theo hai hng chính là: làm tng nhit 
cây và gây mt nc trong cây. Nc là yu t gii hn i vi cây trng, va là sn
phm khi u va là sn phm trung gian và cui cùng ca các quá trình chuyn hoá
sinh hc. Nc là môi trng  các phn ng trao i cht xy ra [2].
S tác ng ca hn, gây nên hin tng co nguyên sinh và làm cho cây b
héo. S co nguyên sinh các t bào din ra khi nng  nc trong môi trng quá
cao hay do hn nc làm cho nc trong t bào tht thoát ra ngoài nên khi.
Hn hán làm gim mnh quang hp. Khi hàm lng nc trong lá còn

 chng li s khô hn [1].
c ta nm trong khu vc nhit i gió mùa hn là yu t tng xuyên tác
ng gây nh hng n sinh trng, phát trin ca cây trng, nh hng xu n
ng sut và phm cht ca chúng. Vì vy, vic nghiên cu các c ch chu hn s
là c s cho vic ci thin ging cng nh to ra c các ging có tính chng chu.
Khi nghiên cu v kh nng chng chu ca các cây trng ly ht ngi ta
thc hin theo nhiu hng khác nhau: phân tích hóa sinh trong ht ny mm 
nghiên cu a dng enzym - amylaza và proteaza hàm lng protein tan, thành
phn axit amim, prolin
Các proteazaóng vai trò quan trng trong c th sng và nht là trong thi
k ny mm ca ht. Chúng rt a dng. Thành phn phc tp ca các proteaza ht
c to ra bi sa dng chc nng do chúng m nhim trong thi k ny mm.
Proteaza nói chung không ch tham gia vào phân gii protein d tr trong ht, nhm
cung cp các axit amin cho thi k phát trin u tiên ca cây mà chúng còn tham gia
vào quá trình vi x lý phân t protein. Proteaza tham gia vào phân gii các protein l
11
hoc b bin tính khi gp u kin cc oan (lnh, mn, hn, tác ng c hc ) [18].
Trn Th Phng Liên (1999) khi nghiên cu so sánh phn di hot tính proteaza
ca các ging u tng chu nóng chu hn khác nhauã nhn xét rng. Proteaza
trong quá trình ht ny mm ca ht  tt c các ging u tng nghiên cu rt a
dng, có hot tính cao, có kh nng phân gii hoàn toàn protein d tr to nguyên
liu  tng hp protein cho c th mi. X lý nhit  cao chnh hng n hot
tính proteaza  mt s ging chu hn, không nh hng n ging chu nóng [18].
Nguyn Th Kim Dung (2003) nghiên cu s bin ng hot  proteaza  giai
on ht ny mm ca các ging lc ã rút ra kt lun, hot  ca proteaza trong
giai on ht ny mm có xu hng tng t 1 n 5 ngày tui, sau ó gim t 7 n
9 ngày tui [6]. Cng theo hng nghiên cu này Nguyn Th Thu Ngà (2007), cho
rng  các giai n ht ny mm làm bin i hot  ca proteaza và hàm lng
protein tan. S bin i này tuân theo quy lut chung : tng  các giai n t 3 n
7 ngày tui, bt u gim  giai n 9 ngày tui, hàm lng protein tan và hot 

iu kin ngoi cnh. Biu hin ca quá trình này là vic sinh tng hp mt lot các
cht trong t bào, mt s hormon hoc cht kích thích  giúp cho cây có kh nng
thích ng. Khi i sâu vào nghiên cu  mc  phân t ca hin tng nóng hn 
thc vt ngi ta ã có nhng bc tip cn khác nhau trên nhiu loài cây trng 
các giai on phát trin khác nhau. c nghiên cu nhiu nht là các protein sn
phm biu hin gen [19]. Nhóm các protein c c bit quan tâm bao gm:
protein sc nhit, môi gii phân t, LEA
Protein sc nhit (heat shock protein- HSP): HSP có  hu ht các loài
thc vt nh: lúa mì, mch, lúa go, ngô, u nành, hành, ti…. chúng chim
khong 1% protein tng s trong lá ca các loài thc vt này. HSP c tng hp
khi t bào gp iu kin cc oan nh: hn, nhit  cao,  mui cao. S xut hin
ca HSP có chc nng ngn cn hoc sa cha s phá y do stress nóng và m
rng giá tr ngng vi s chng chu nhit  cao. Trong các t bào thc vt HSP
t bào cht tp trung thành các ht sc nhit (HSG-Heat Shock Granules). Ngi ta
cho rng các HSP gn kt trên các ARN polymeraza  ngn cn s phiên mã tng
hp mARN trong quá trình b stress nóng. Sau sc nóng các ht này phân tán và
liên kt dày c vi các ribôxôm hot ng sinh tng hp protein [19].
13
HSP có th chia làm 6 nhóm da trên c s khi lng phân t khác nhau:
110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa. Trong ó có nhóm HSP70 và HSP 60 có nhiu i
din ca cht môi gii phân t (gi là chaperonin) HSP 8,5 kDa (Ubiquitin) có chc
ng bo v cho t bào nhng không phi là môi gii phân t. Ubiquitin có hot
tính proteaza vi chc nng phân gii các protein không có hot tính enzym.
Ubiquitin có MW rt thp, ít chu nh hng ca nhit  nên có vai trò t sa cha
ca t bào khi gp yu t cc oan, c bit là nhit  cao [19].
Môi gii phân t (MGPT): MGPT là mt nhóm gm nhóm gm nhiu loi
protein khác nhau, nhng chúng u có chc nng tham gia to cu trúc không gian
úng cho protein trong t bào. Phn ln các cht MGPT có hot tính ATP-aza, có
chc nng: (1) Gin nh chui polypeptit khi ang tng hp và to cu trúc
không gian úng cho chúng, (2) To li cu trúc không gian ca protein sau khi vn

1.2.3. Nghiên cu v tính chu hn  cây u tng
Trong các cây trng ly ht thì cây u tng có nhu cu v nc cao hn
các loi cây khác. ó chính là do trong ht và cây u tng có hàm lng protein
và lipit rt cao,  tng hp 1kg cht khô cn 500 - 530 kg nc. Trong quá trình
ny mm thì nhu cu v nc ca u tng cng khá cao 50%, trong khi ó  ngô
ch là 30%, lúa là 26% [20 ].
Nghiên cu v các c tính chu hn ca cây u tng v phng din sinh
lý và di truyn ã cho thy rng, các c tính này liên quan cht chn c m
hoá keo ca nguyên sinh cht, c m ca quá trình trao i cht. Tính chu hn
ca cây u tng là tính trng a gen. Chúng th hin  nhiu khía cnh khác nhau
nh: v s phát trin ca b r, tính chín sm tng i, cng nh bn cht di
truyn ca tng ging có kh nng s dng nc tit kim trong quá trình sinh
trng và phát trin ca cây. n c vào c m này, u tng c chia thành
hai nhóm [18].
- Nhóm chu c s mt nc trong tng giai n phát trin ca cây.
- Nhóm chu c s thiu nc trong tt c giai n phát trin ca cây.
15
 giai n cây con khi gp hn, u tng có th d vt qua hn, còn 
nhng giai n sau nh giai on ra hoa, kt qu, ht chín sa mà gp hn thì s
dn n nng sut gim áng k.
Trong nhng nm gn ây các nhà khoa hc ã có nhiu thành công khi
nghiên cu sâu hn v tính chu hn ca cây u tng.
Maitra và Cushman (1994) ã phân lp c cDNA ca dehydrin t lá u
ng khi b mt nc, ngoài ra các tác gi còn phân lp c cDNA ca LEA nhóm D
- 95 t lá và r cây u tng khi b hn [36].
Jinn và các tác gi khác (1997) nghiên cu v sHSP nhóm 1 (15-18 kDa) ã
nhn thy, chúng tng lên  lng ln trong mm u tng di tác ng ca nhit
c tìm thy  cu trúc dng ht trong nguyên sinh cht và trong nhân cùng vi
protein b bin tính.[35].
m 2004, nhóm nghiên cu gm Huang và cs ca Trng i hc T

chúng là yu t quyt nh làm cho u tng tr thành ngun thc phm quan
trng cho ngi và thc n cho gia súc.
1.3.3. u tng là loi cây có nhu cu v nc cao hn các loi cây trng
khác, thuc vào nhóm chu hn kém. Hn ã nh hng ln n quá trình sinh trng,
phát trin ca cây u tng và làm gim nng sut, cht lng. Nghiên cu v tính
chu hn ca cây u tng ngi ta thc hin theo nhiu hng khác nhau: phân tích
hóa sinh trong ht ny mm  nghiên cu a dng enzym - amylaza và proteaza hàm
ng protein tan, thành phn axit amin i sâu vào nghiên cu  mc  phân t,
c nghiên cu nhiu nht là các protein sn phm biu hin gen. Nhóm các protein
c c bit quan tâm bao gm: protein sc nhit, môi gii phân t, LEA
1.3.4. Trên th gii ã thành công trong vic nghiên cu gen mã hóa protein
u tng và các trình t gen này ã c công b trên ngân hàng gen th gii.
Ti Vit Nam, ã có mt s tác gi nghiên cu v tính chu hn và ã phân lp, gii
trình t gen liên quan n tính chu hn ca cây u tng, trong ó có chaperonin
trên các ging u tng khác nhau. Tuy nhiên, vic nghiên cu các ging u
ng a phng ca các tnh  khu vc Tây Nguyên còn ít c quan tâm chú ý.
17
Chng 2
NGUYÊN LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU
2.1. NGUYÊN LIU
2.1.1. Nguyên liu thc vt
Các ging u tng a phng: Azmpa- Gia Lai (AZP), Sa Thy -
Kon Tum (ST), Chmnga-k Lk (CNg) do Trung tâm Tài nguyên Di truyn
thc vt - Vin Khoa hc Nông nghip Vit Nam cung cp.
Ging a phng Duy Linh- Lâm ng (DL) và ging i chng HN9 do
Trung tâm Khuyn Nông tnh k Lk cung cp.
Bng 2.1. Ngun gc ca các ging u tng nghiên cu
TT
Tên ging Ký hiu Ngun gc
1 Duy Linh DL Ging a phng, Duy linh- Lâm ng

18
- Máy phân tích axit amin t ng - HP amino Quan SeriesII (Hewlett
Parkard, M)
- Máy phân tích trình t gen ABI 3100 Genetic Analyzer (M)
- Bn nhit (Techne, OSI, Anh)
- Pipetman các loi (Gilson, Pháp)
- T sy (Anh)
- Cân in t (Thu S)
- T lnh sâu – 85
0
C (Sanyo, Nht Bn)
- Ni kh trùng (Tomy- Nht)
- Máy PCR (ABI System, M)
- Máy soi ADN (Bio-Rad, M)
- Máy li tâm lnh (c)
- Máy khuy trn Voltex (c)
- Máy o pH (Metter Toledo, Thy S)
a m nghiên cu: Các thí nghim c thc hin ti Phòng thí nghim
Di truyn hc và Công ngh gen, Khoa Sinh- KTNN, Trng i hc S phm -
i hc Thái Nguyên. Các phân tích axit amin tng và xác nh trình t gen
c thc hin ti Phòng thí nghim trng m Công ngh gen, Vin Công ngh
sinh hc, Vin Khoa hc và Công ngh Viêt Nam.
2.2. PHNG PHÁP NGHIÊN CU
2.2.1 Phng pháp hoá sinh
2.2.1.1. Phân tích hóa sinh  giai n ht tim sinh
(1) Xác nh hàm lng lipit
Da vào tính cht hoà tan ca lipit trong dung môi hu c chit rút, dung
môi hu cc s dng là petroleum ether [24].
Mu em sy khô, bóc v, nghin mn. Cân 0,05g mu cho vào mi ng
Eppendorf (3 ng Eppendorf / mu). Tip theo, cho 1,5ml petroleum ether vào mi

x 100%
Trong ó :
X : hàm lng protein (% khi lng khô)
A : nng  thu c khi o trên máy (mg /ml )
HSPL: h s pha loãng
m: khi lng mu (mg)
(3) Xác nh hàm lng và thành phn axit amin trong ht
Hàm lng axit amin c xác nh trên máy HP - Amino Quant s dng
ortho-phtalADNehyt to dn xut i vi các axit amin bc 1 và 9 - fluoreryl -
metyl - cloroformat i vi các axit amin bc 2. Mu c x lý theo phng pháp
thu phân pha lng theo hng dn s dng máy phân tích axit amin tng.
2.2.1.2 ánh giá kh nng chu hn thông qua phân tích mt s ch tiêu hóa
sinh  giai n ht ny mm
(1) Chun b mu
Ht các ging u tng c ngâm trong nc 1h, sau ó c m
bng dung dch MS pha loãng 10 ln cha sorbitol 7%. Ht ny mm sau các
20
thi gian  1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày c ly  xác nh hot 
c proteaza và hàm lng protein tan. i chng là ht u tng c  bng
c không cha sorbitol.
(2) Xác nh hot  ca proteaza
Hot  enzym proteaza xác nh theo phng pháp Anson ci tin theo mô
t ca Nguyn Vn Mùi ( 2001) [27].
Ht ny mm bóc v la, cân khi lng, nghin nh, chit bng m
phosphat pH= 6,5 li tâm 12000 vòng/phút  4
o
c, dch thu c s dng làm thí
nghim. Thí nghim c tin hành trên ng thí nghim, ng kim tra, o trên máy
quang ph bc sóng 750 nm. Hot  enzym proteaza c tính da trên  th
ng chun xây dng bng tyrosin, và c tính theo công thc:

Tng s cây x lý
(%)
(2) Xác nh kh nng gi nc qua các giai n x lý bi hn theo công thc
(%)
ft
fc
W
W
W
=
Trong ó:
W(%): Kh nng gi nc ca cây sau khi x lý bi hn
W
ft
(g): Khi lng ti ca cây sau khi x lý bi hn (g)
W
fc
(g): Khi lng ti ca cây không x lý (g)
(3) Xác nh t l thit hi do hn gây ra c tính theo công thc
()
(%)
o
Nb
a
NC
=
∑
Trong ó:
a: T l thit hi do hn gây ra (%);
b: Tr s thit hi ca mi cp;

0
C ri xác nh khi lng khô tuyt i.
- Xác nh t s chu hn
T = W
r
/W
tl
Trong ó :
T: T s khi lng ca r/ thân lá khô
W
r
: Khi lng khô ca r (mg)
W
tl
: Khi lng khô ca thân lá (mg)
(6) Xác nh hàm lng prolin theo Bastes (1973) [33].
Tách chit prolin: Nghin 0,5 gram thân lá cây u tng ã x lý hn 
ngng trc hn, hn 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày trong ci chày x, thêm 10ml dung
dch axit sunfosalisilic 3 %, li tâm 8000 vòng /phút trong 30 phút.Thu dch làm thí
nghim. o hp th quang ph bc sóng 520 nm.
Hàm lng prolin c tính theo công thc:
X % =
m
AxHSPL
x 100%
23
Trong ó:
X : Hàm lng prolin (%)
A : Nng  thu c khi o trên máy (mg /ml)
HSPL: H s pha loãng

- Thêm 700µl m tách, mix nh,  65
0
C trong 2h, sau ó ly ra  nhit
 phòng 5 phút.
- Thêm 600µl cloroform:isoamyl alcohol ( 24:1 ), trn u 20 phút
- Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút. Hút cn thn 500µl dch trong sang ng
eppendorf 1,5 ml mi ( b ta).