Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

1
MỞ ðẦU

I. LÝ DO CHỌN ðỀ TÀI
ðậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] là một trong ba cây ñậu ñỗ chính
trong nhóm các cây ñậu ăn hạt, ñứng sau ñậu tương và lạc. Ngoài ra, nó còn là
một trong những mặt hàng xuất khẩu. ðậu xanh cũng chính là cây trồng có vị
trí quan trọng trong nền nông nghiệp của nhiều nước, trong ñó có Việt Nam.
Trồng ñậu xanh không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu ñạm, ñáp
ứng nhu cầu về dinh dưỡng của con người và vật nuôi, mà còn có tác dụng
cải tạo và bồi dưỡng ñất do rễ của cây ñậu xanh có các nốt sần chứa một số
loài vi sinh vật cố ñịnh ñạm sống cộng sinh.
Vấn ñề ñặt ra là cần nghiên cứu chọn tạo các giống ñậu xanh có chất
lượng tốt, phục vụ nhu cầu trong nước cũng như xuất khẩu. Hiện nay, việc
nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng nói chung và ñậu xanh nói riêng nhờ
chỉ thị phân tử ñã và ñang ñược áp dụng rộng rãi. Các nhà khoa học ñã sử
dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử như RAPD, AFLP, RFLP, SSR…ñể
xác ñịnh quan hệ di truyền của cây trồng nhằm tạo cơ sở khoa học cho công
tác chọn tạo giống cây trồng. Trên thế giới, kỹ thuật RAPD ñã ñược nhiều
tác giả sử dụng ñể nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống ñậu xanh
như: Afzal và ñtg (2004), Betal và ñtg (2004), Lakhanpaul và ñtg (2000)...
[25], [27], [37]. Ở Việt Nam, kỹ thuật RAPD cũng ñã ñược các tác giả Chu
Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, ðiêu Thị Mai Hoa sử dụng ñể xác
ñịnh quan hệ di truyền của các giống ñậu xanh ñột biến, các giống ñậu xanh
chịu hạn, các giống chín tập trung và không tập trung ở ñậu xanh [4],
[16], [21].
Nhằm tạo cơ sở cho việc lựa chọn giống ñậu xanh có chất lượng tốt


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ðẬU XANH
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ñậu xanh
Cây ñậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczeck) thuộc ngành
Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Fabales, họ Fabaceae, chi Vigna. Chi
Vigna là một trong những chi lớn trong họ ðậu, bao gồm 7 chi phụ: Vigna,
Haydonia, Plactropic, Macrhyncha, Ceratotropic, Lasiospron,
Sigmaidotrotopis. ðậu xanh theo quan ñiểm lấy hạt của nhân dân ta bao gồm
các loài thuộc hai chi phụ là Ceratotropic, còn ñược gọi là nhóm ñậu châu Á,
bao gồm 16 loài hoang dại và 5 loài trồng trọt là V. radiata, V. mungo, V.
aconitifolia, V. angularis, V. umbellata [6], [14].
ðậu xanh có bộ NST 2n = 22, là loại cây ăn hạt, thân thảo. Theo
Vavilov, ñậu xanh có nguồn gốc từ Ấn ðộ, ñược phân bố rộng rãi ở các nước
ðông và Nam Á, khu vực ðông Dương. Dạng dại của V. radiata cũng ñược
tìm thấy ở Madagasca, bên bờ Ấn ðộ Dương, ðông Phi [16].

1.1.2. ðặc ñiểm nông sinh học của cây ñậu xanh
ðậu xanh là loại cây trồng cạn thu quả và hạt, bao gồm các bộ phận rễ,
thân, lá, hoa, quả, hạt.
Rễ ñậu xanh thuộc loại rễ cọc, bao gồm rễ cái và rễ con. Rễ cái sâu
khoảng 20 - 30 cm, có khi sâu tới 70 - 100 cm [6]. Rễ phụ thường gồm 30 -
40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm. Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu bì rễ

phát triển thành 2 hàng hoa mọc ñối nhau, các hoa trên hàng xếp liên tục với
nhau tạo cho trục hoa có hình dạng co rút. Hoa ñậu xanh là hoa lưỡng tính,
mọc thành chùm trên trục hoa. ðậu xanh là loại cây sinh trưởng vô hạn, hoa
có màu tím hoặc vàng nhạt với công thức hoa là K5C5A10G1. ðậu xanh là
loài thực vật tự thụ phấn cao, tỷ lệ hoa thành quả chỉ từ 10 - 25 %. Thụ tinh
xong, tràng hoa rụng, quả hình thành và phát triển [14].
Quả ñậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹt, dài từ
8 - 10 cm, ñường kính từ 4 - 6 mm, có 2 gân nổi rõ dọc theo 2 bên cạnh quả.
Quả chín có màu vàng, nâu hoặc màu ñen. Cũng như các bộ phận khác ở cây
ñậu xanh, trên vỏ quả ñậu xanh thường bao phủ một lớp lông dài khoảng
0,3 - 0,4 mm. Những giống thuộc nhóm kháng virus gây bệnh khảm vàng và
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

5
sâu ñục quả thì mật ñộ lông khá dày, màu trắng. Mỗi cây có từ 8 - 35 quả, mỗi
quả có từ 8 - 15 hạt [16], [22].
Hạt ñậu xanh có hình trụ, thuôn, tròn ñều, có màu xanh bóng, xanh xám,
vàng, xanh mốc, hoặc ñen xám… nằm ngăn cách nhau bằng những vách xốp
của quả. Khối lượng hạt ñược biểu thị bằng g/1000 hạt và khối lượng nghìn hạt
có thể dao ñộng từ 25 - 70 g. Số hạt trên quả và khối lượng hạt có tương quan
thuận với năng suất. ðậu xanh là cây trồng ngắn ngày, trồng vào mùa ấm áp,
nhiệt ñộ tối ưu cho cây sinh trưởng và phát triển từ 20 - 30
0
C [11], [16].
1.1.3. Tầm quan trọng của cây ñậu xanh
Cây ñậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao. Hạt ñậu xanh là
nguồn thực phẩm giàu ñạm (khoảng 24 - 28%), ngoài ra, còn có lipid khoảng
1,3%, glucid 60,2% và các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K, P… cùng nhiều

1.2.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống ñậu xanh
Ngay từ khi con người biết trồng trọt thì các phương pháp chọn lọc khác
nhau ñã ñược ứng dụng nhằm tạo ra những cây trồng theo ý muốn. Ngày nay,
với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ñặc biệt trong lĩnh vực công nghệ
sinh học, chọn giống cây trồng bằng phương pháp sinh học phân tử ñã ñem lại
những kết quả ñáng tin cậy và thay thế dần cho phương pháp chọn giống cổ
truyền. Phương pháp chọn tạo giống cây trồng nhờ chỉ thị phân tử ñã ñược áp
dụng bởi nó có ưu ñiểm là nhanh chóng ñánh giá ñược bộ gen của các giống
cây trồng với ñộ chính xác cao. Một hướng nghiên cứu ứng dụng sinh học
phân tử trong chọn tạo giống ñậu xanh là việc xây dựng bản ñồ di truyền phân
tử. Gần ñây, nhiều bản ñồ di truyền phân tử ñã ñược công bố bao gồm các chỉ
thị phân tử RFLP, RAPD và một số chỉ thị khác [16].
Hiện nay, công tác chọn tạo giống ñậu xanh trên thế giới ñược tiến hành
theo một số hướng chính: tạo giống cho năng suất cao, tạo giống nâng cao
chất lượng [6], tạo giống có khả năng chống chịu tốt, tạo giống có khả năng
kháng sâu, bệnh hại [28], [34].
Cùng với việc áp dụng sinh học phân tử vào nghiên cứu ñậu xanh của
các nước trên thế giới, ở Việt Nam bước ñầu cũng có nhiều ứng dụng và ñã
thu ñược những kết quả khá quan trọng.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

7
Từ sau cách mạng tháng 8 - 1945, chúng ta ñã xây dựng ñược nhiều
trạm nghiên cứu thí nghiệm về ñậu ñỗ nói chung và về ñậu xanh nói riêng ở
nhiều nơi khác nhau như ở ðịnh Tường (Thanh Hoá), Mai Nham (Vĩnh
Phúc), Pú Nhung (Lai Châu), Thất Khê (Cao Bằng) và ñã tiến hành thu thập,
chọn tạo ra nhiều giống mới với các ñặc tính ưu việt hơn trước.
Từ những năm 1980 ñến nay, nước ta có thêm nhiều cơ sở nghiên cứu về

xanh cho năng suất từ 10 - 12 tạ/ha trở lên, hạt to, màu hạt ñẹp, thời gian sinh
trưởng ngắn, chín tập trung, có sức chống chịu tốt với các ñiều kiện cực ñoan
của môi trường [14], [24].
Tính ñến năm 2001, Ấn ðộ là nước ñứng ñầu thế giới trong việc sản xuất
ñậu xanh với diện tích gần 2887000 ha (chiếm trên 70% diện tích ñậu xanh
toàn cầu), sản lượng ñạt trên 1 triệu tấn, tiếp theo là Trung Quốc (diện tích
772000 ha, sản lượng 0,891 triệu tấn). Trung Quốc là nước có năng suất sản
xuất ñậu xanh cao nhất, ñạt 1,15 tấn/ha. Thái Lan là nước ñứng ñầu thế giới
về xuất khẩu ñậu xanh, chiếm khoảng 40% sản lượng ñậu xanh xuất khẩu trên
thế giới. Những nước nhập nhiều ñậu xanh là Nhật Bản (80 tấn/năm), Hoa Kỳ
(50 tấn/năm) (Nguồn : FAOSTAT 2002) [24].
Ở Việt Nam, cây ñậu xanh cũng ñược trồng từ lâu ñời ở các vùng ñồng
bằng, trung du và miền núi trên khắp cả nước. Tuy nhiên, nó vẫn chỉ ñược xem
như một loại cây trồng phụ nhằm tận dụng ñất ñai, lao ñộng dư thừa,… Vì thế,
năng suất sản xuất ñậu xanh còn chưa cao. Từ năm 1991 - 1995 năng suất sản
xuất ñậu xanh ñạt từ 5,5 tạ/ha ñến 12 tạ/ha. Từ năm 1996 - 2000 năng suất dao
ñộng trong khoảng 15 - 20 tạ/ha. ðến năm 2000, Việt Nam có diện tích và sản
lượng ñậu xanh ñứng thứ 6 trên thế giới [7], [8], [9], [10], [11].
1.3. NGHIÊN CỨU QUAN HỆ DI TRUYỀN Ở ðẬU XANH
1.3.1. Một số phương pháp sinh học phân tử trong phân tích quan hệ di
truyền ở thực vật
1.3.1.1. Kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - ña hình các
ñoạn DNA ñược khuếch ñại ngẫu nhiên) do William phát minh năm 1990,
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

9
Welsh và cộng sự hoàn thiện năm 1991. Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

10
tiến hành phản ứng thường là 0,1- 0,5 µM. Mồi ñược thiết kế ñảm bảo các
yêu cầu sau:
+ Trình tự mồi phải có tính ñặc hiệu cao, bắt cặp tuyệt ñối với ñầu mạch
khuôn, không có cấu trúc “kẹp tóc”, giàu G và C (chiếm 60%).
+ Nhiệt ñộ gắn mồi thấp hơn nhiệt ñộ nóng chảy (Tm) của mồi từ 1
0
- 2
0
C [1],
[2], [19].
- Taq-polymerase: là một enzyme quan trọng, có vai trò quyết ñịnh ñến
phản ứng PCR. ðây là loại enzyme chịu ñược nhiệt ñộ cao trong các loại
enzyme. ðặc ñiểm của chúng là có khả năng kéo dài mồi ñể tạo một sản phẩm
có chiều dài 8 - 13 kb. Taq-polymerase ñược tách chiết từ chủng vi khuẩn ở
suối nước nóng Thermus aquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt ñộ biến
tính DNA (92
o
- 95
0
C). Taq - polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt ñộ cao, tồn
tại ở nhiệt ñộ ủ 95
0
C kéo dài. Enzyme này có hoạt tính cao ở 72
0
- 80
0

* Chu kỳ phản ứng
Phản ứng RAPD ñược tiến hành qua các giai ñoạn sau:
- Giai ñoạn biến tính DNA: Ở nhiệt ñộ 95
0
C trong 30 - 60 giây làm cho
các liên kết hydro giữa 2 mạch bị ñứt. Khi ñó DNA sợi ñôi tách thành 2 sợi
ñơn tạo ñiều kiện cho sự bắt cặp mồi.
- Giai ñoạn tiếp hợp mồi: Nhiệt ñộ hạ xuống 32
0
- 40
0
C, mồi bám vào
ñầu 3
’
OH của mạch khuôn DNA và bắt ñầu quá trình tổng hợp sợi mới.
- Giai ñoạn tổng hợp: Nhiệt ñộ ñược nâng lên 72
0
C thì các ñoạn mồi ñã
bắt cặp với các mạch ñơn sẽ ñược kéo dài với sự tham gia của Taq -
polymerase.
Một chu kỳ trên xảy ra, 1 ñoạn DNA ñược nhân lên thành 2, các ñoạn
DNA ñược nhân tiếp tục ñược coi là mạch khuôn ñể tổng hợp cho chu kì sau.
Vậy, sau n chu kỳ thì sẽ tạo ra 2
n
các ñoạn DNA giống hệt ñoạn DNA khuôn
ban ñầu. Phản ứng RAPD có thể thực hiện 40 - 45 chu kỳ.
1.3.1.2. Kỹ thuật RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - ña hình ñộ dài các
ñoạn cắt giới hạn) là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA hệ
gen ở trình tự nhận biết ñặc trưng tạo ra hàng loạt ñoạn DNA có ñộ dài xác

SSR (Simple Sequence Repeats - trình tự lặp lại ñơn giản) hay còn gọi là
vi vệ tinh (microsatellites). Kỹ thuật này ñược Litt và Luty phát triển năm
1989 dựa trên nguyên tắc của phản ứng PCR. Trong cấu trúc hệ gen của sinh
vật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình tự nucleotide lặp lại, chúng ñặc trưng
cho loài. SSR gồm 2 - 5 nucleotide lặp lại nhiều lần. Thông thường, các SSR
có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của NST, như vùng tâm ñộng hoặc
các ñầu mút. Chúng giữ vai trò quan trọng trong việc ñiều hòa hoạt ñộng của
các gen, góp phần làm tăng tính ổn ñịnh cơ học của NST trong các quá trình
phân bào và có thể chứa ñựng những thông tin di truyền liên quan ñến sự xác
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

13
ñịnh giới tính ở cả ñộng vật và thực vật. Do sự khác nhau về số lượng
nucleotide trong mỗi ñơn vị lặp lại mà sự ña hình về ñộ dài của SSR ñược
nhân bản sẽ ñược phát hiện sau quá trình ñiện di trên gel agarose hay
polyacrylamide. SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống
cây trồng, do khả năng phát hiện tính ña hình rất cao. Song chỉ thị này có
nhược ñiểm là sự phức tạp trong thiết kế mồi và giá thành thiết kế mồi cao.
Trong thực tế, chỉ thị này ñã ñược sử dụng ñể nghiên cứu một số tính trạng
liên quan ñến năng suất, bệnh hại, xác ñịnh giới tính, phân tích quan hệ di
truyền, lập bản ñồ gen…[48]. Nguyễn Vũ Thanh Thanh ñã sử dụng kỹ thuật
SSR ñể nghiên cứu tính ña dạng di truyền của một số giống ñậu xanh chịu hạn
khác nhau [21].
1.3.1.5. Bản ñồ QTL
Bản ñồ QTL (Quantitative Trait Loci - bản ñồ các locus tính trạng số lượng)
xác ñịnh mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một tính trạng hình thái ñang ñược
quan tâm. Qua bản ñồ QTL có thể xác ñịnh ñược những vùng trên NST có liên
quan ñến một tính trạng hình thái. ðể lập bản ñồ QTL, cần tiến hành:

Nguyễn Vũ Thanh Thanh ñã sử dụng kỹ thuật RAPD với 20 mồi ngẫu
nhiên, trong ñó có 18 mồi thể hiện tính ña hình và kỹ thuật SSR với 10 mồi
ngẫu nhiên ñể nghiên cứu sự ña dạng di truyền của các giống ñậu xanh có khả
năng chịu hạn khác nhau. Kết quả nhận ñược 79 phân ñoạn DNA với 18 mồi
RAPD và 91 phân ñoạn với 10 mồi SSR. Từ ñó thiết lập biểu ñồ hình cây xác
ñịnh quan hệ di truyền của các giống ñậu xanh [21].
Trên thế giới, việc áp dụng kỹ thuật RAPD ñể nghiên cứu quan hệ di
truyền có phần ña dạng hơn. Năm 1998, Santalla M. và ñtg nghiên cứu tính ña
dạng di truyền ở cây ñậu xanh bằng kỹ thuật này với 60 mồi ngẫu nhiên.
Kết quả ñiện di cho thấy tổng số có 246 phân ñoạn DNA ñược khuếch ñại,
trong ñó có 229 phân ñoạn thể hiện tính ña hình [47]. Cũng trên ñậu xanh,
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

15
Saini A. và ñtg ñã sử dụng các mồi ngắn (10 nucleotide) trong phản ứng
RAPD và ñể ñánh giá quan hệ di truyền của 46 giống ñậu xanh [45].
Năm 2000, Lakhanpaul và ñtg sử dụng kỹ thuật RAPD nhằm phân tích
ña hình DNA của các giống ñậu xanh Ấn ðộ. Nhóm tác giả sử dụng 21 mồi
ngẫu nhiên và thu ñược 267 băng DNA, trong ñó 64% là ña hình [37].
Betal và ñtg (2004) ñã sử dụng 14 giống ñậu xanh cùng 14 mồi ngẫu
nhiên ñể phân tích mối quan hệ di truyền nhờ kỹ thuật RAPD. Kết quả cho
thấy các giống có năng suất cao có liên quan chặt chẽ với tính trạng mùi thơm
của hạt. Kết quả nghiên cứu của tác giả cũng chỉ ra rằng tính trạng năng suất
có mối liên quan với ñặc ñiểm hình thái như chiều cao cây, kích cỡ và màu
sắc hạt [27] .
Afzal và ñtg (2004) nghiên cứu sự ña dạng di truyền của tập ñoàn giống
ñậu xanh nhờ kỹ thuật RAPD. Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng 21
giống ñậu xanh với 34 mồi ngẫu nhiên kết quả thu ñược tổng số 204 phân

giống chè ở Hy Lạp nhờ kỹ thuật RAPD. Họ sử dụng 25 mồi ngẫu nhiên ñể
khuếch ñại các ñoạn DNA của 7 giống chè. Kết quả cho 282 băng, trong ñó
có 195 băng thể hiện tính ña hình. Nghiên cứu cho thấy những giống chè ở
Hy Lạp có thể hiện tính ña dạng di truyền [35].
Paulo .S (2004) xác ñịnh mối quan hệ di truyền của 81 giống ngô (Zea
mays) ở phía Nam Brazil nhờ chỉ thị RAPD. Trong nghiên cứu này, tác giả sử
dụng 32 mồi ngẫu nhiên và kết quả thu ñược 225 băng, trong ñó có 184 băng
thể hiện tính ña hình (chiếm 72,2%). Từ kết quả này, cây phả hệ ñược thành
lập bằng cách sử dụng phần mềm UPGMA. Kết quả nghiên cứu này sẽ ñược
sử dụng ñể chứng minh và duy trì nguồn gen từ ngô [42].
Dey N. và ñtg (2005) nghiên cứu tính ña dạng di truyền của 38 dòng lúa
thơm và 2 dòng ñối chứng. Nhóm tác giả ñã tiến hành phản ứng RAPD với 5
mồi ngẫu nhiên. Kết quả khuếch ñại ñược 44 băng DNA, với kích thước từ
500 - 3500 bp. Trong 44 băng có 41 băng thể hiện tính ña hình [29].
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

17
Subramanian V. và ñtg (2006) ñã nghiên cứu tính ña hình DNA ở cây lạc
nhờ kỹ thuật RAPD. Nhóm tác giả ñã sử dụng 48 mồi ngẫu nhiên và xác ñịnh
ñược 7 mồi (14,6%) ña hình. Tổng số băng DNA ñược tạo ra từ 7 mồi ñó là
408 băng, trong ñó có 27 băng thể hiện tính ña hình [51].
Awan F. S. (2007) sử dụng kỹ thuật RAPD ñể xác ñịnh mối quan hệ di
truyền của 7 giống lúa mì ở Pakistan (6 giống nhập nội và 1 giống khác). Kết
quả có 112 băng DNA ñược tạo ra từ 15 mồi ngẫu nhiên, trong ñó có 50 băng
thể hiện tính ña hình, mối tương ñồng di truyền là 86,2 - 93%. ðiều này cho
biết mối quan hệ gần gũi của các giống lúa mì này [26].
Venkata C. L. và ñtg (2007) ñã xác ñịnh tính ña hình DNA ở 21 giống
chuối ở Nam Ấn ðộ nhờ chỉ thị RAPD và ISSR. Phản ứng RAPD ñược thực

băng ña hình. Kết quả phân tích NTSYS-SIMQUAL cho thấy các giống tằm
nghiên cứu có mối tương ñồng di truyền trong khoảng 0,547 ñến 0,984 [3].