LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này
Trước hết tôi xin gởi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban
Giấm Đốc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường niềm kính trọng, sự tự hào
được học tập tại trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc tới thầy: Th.s Lê Phương Chung – Viện Công Nghệ Sinh
Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và Th.s Nguyễn Trọng Lực –
Trưởng phòng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật – Trung Tâm Ứng Dụng Và
Chuyển Giao Công Nghệ - Sở Khoa Học Và Công Nghệ tỉnh Phú yên đã tận tình
hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ
Môn Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và các anh
chị trong Trung Tâm Ứng Dụng và Chuyển Giao Công Nghệ – Sở Khoa Học Và
Công Nghệ tỉnh Phú yên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
thời gian tôi thực hiện đồ án này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều
kiên, động viên, khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa
qua
Nha trang, ngày tháng 7 năm 2012
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Huỳnh Uyên

i
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v

1.1.7.3. Giai đoạn nhân nhanh 19
1.1.7.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 19
1.1.7.5. Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm 20
1.1.8. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nhân giống nuôi cấy mô TBTV 20
1.1.8.1. Điều kiện vô trùng 20
1.1.8.2. Ánh sáng và nhiệt độ 22
1.1.8.3. pH môi trường 23
1.2. Giới thiệu về cây lan gấm 23
1.2.1. Phân loại thực vật 23
1.2.2. Đăc điểm thực vật 24
1.2.3. Sự phân bố 26
1.2.4. Tính dược liệu và công dụng 26
1.2.5. Tình hình nghiên cứu cây lan gấm 27
CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 28
2.1.3. Điều kiện nuôi cấy 28
2.2. Nội dung nghiên cứu. 29
2.3. Địa điểm thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu. 30
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu. 30
2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm. 30
2.4.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô mẫu cây lan Gấm 30
2.4.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi. 32
2.4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả
năng nhân nhanh chồi 33

iii
2.4.1.4. Thí nghiệm 4 : Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
đến khả năng nhân nhanh chồi 33
2.4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng nhân nhanh 35
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu. 36

Bảng 2.4. Ảnh hưởng của các nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi. 34
Bảng 2.5. Ảnh hưởng của các nồng độ TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi. 35
Bảng 2.6: Khảo sát quá trình nhân nhanh 36
Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Javen 37
Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Chlorine 39
Bảng 3.3. Hiệu quả khử trùng với sự kết hợp Javen và Chlorine. 40
Bảng 3.4. So sánh hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. 41
Bảng 3.5. Khả năng tái sinh chồi mẫu cấy 42
Bảng 3.6. Ảnh hưởng môi trường khoáng thích hợp nhân nhanh lan gấm. 45
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi 47
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi 49
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi sau 6tuần nuôi cấy51
Bảng 3.10. Khảo sát quá trình nhân nhanh 53 v
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây lan gấm Anoectochilus setaceus Blume 25
Hình 3.1. Biểu đồ hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. 41
Hình 3.2. Mẫu sau khi khử trùng 42
Hình 3.3. Sự tái sinh chồi 44
Hình 3.4. Sự phát triển hình thái chồi trên các môi trường khoáng 46
Hình 3.5. Sự phát triển hình thái chồi với các nồng độ BA khác nhau 48
Hình 3.6. Sự phát triển của chồi với các nồng độ Kinetin khác nhau 50
Hình 3.7. Sự phát triển của chồi với các nồng độ TDZ khác nhau 52
Hình 3.8. Khảo sát quá trình nhân nhanh 54
Hình 3.9. Khảo sát quá trình nhân nhanh protocorm 55
Hình 3.10. Quy trình nhân nhanh lan gấm 56


nhiều nhược điểm như mất thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân
thấp, dễ bị thoái hoá qua nhiều thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lượng
cây không đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ. , Hơn nữa, hạt lan lại quá
nhỏ, chỉ có một phôi; nảy mầm cần sự có mặt của nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm
trong tự nhiên là rất thấp. Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay người ta tiến
hành nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực, cây con được tạo ra
với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, chất lượng đảm bảo, sạch bệnh, giá thành
phù hợp và không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết. Nhờ đó đáp ứng nhu cầu không
ngừng tăng lên của thị trường Đây là điều mà phương pháp truyền thống không
thực hiện được.
Nói đến chi lan gấm Anoectochilus, thì loài lan gấm Anoectochilus setaceus
Blume được biết đến nhiều hơn cả không chỉ bởi giá trị làm cảnh do lá và hoa đẹp
mà còn vì giá trị làm thuốc của nó. Theo các tài liệu y học thế giới, lan gấm là loài
cây thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, phòng bệnh, có tính kháng
khuẩn, làm khí huyết lưu thông, chữa các bệnh viêm khí quản, lao phổi, chống tăng

2
huyết áp, đau nhức khớp xương…Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả
năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này.
Như vậy, lan Gấm Anoectochilus setaceus. Blume là loại thảo dược có giá trị
và có tiềm năng rất lớn.Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam số lượng loài này trong tự
nhiên được phát hiện còn rất ít mà lại bị thu hái cả cây với số lượng lớn để bán làm
thuốc (500,000VNĐ/ kg tươi) do vậy loài lan này đang bị đe doạ mạnh và đứng
trước nguy cơ tuyệt chủng nếu không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan
Gấm được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP; và nhóm thực vật đang
nguy cấp EN A1a, c, d trong Sách Đỏ Việt Nam 2007.
Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự cho phép của Bộ môn Công nghệ
sinh học- Viện công nghệ sinh học và môi trường - trường Đại học Nha Trang, tôi
tiến hành đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm (Anoectochilus
setaceus Blume) ” tìm ra điều kiện thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm bằng kỹ

của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo ông: “Tế bào

4
bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền
(DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào
đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”.
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, các nhà khoa học đã chứng
minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng
rẽ.[7]
1.1.2.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào
Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể
hiện một chức năng nào đó.
Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ
tế bào phôi. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này
quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình
đó gọi là quá trình phản biệt hóa.
Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt
hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào càng
chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy ra quá trình
phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật, tế bào.
Người ta đã tổng kết rằng; những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao
nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu.
Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các
tế bào của cơ quan sinh sản (hạt phấn, noãn) rất dễ xảy ra quá trình phản biệt hóa.
Vì vậy nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả
năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều
hướng từ ngọn xuống gốc.
1.1.2.3. Sự trẻ hoá
Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần cơ quan thực vật là rất khác nhau. Vì

quốc tế.

6
- Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời
gian nào, không phụ thuộc mùa vụ.[4]
1.1.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV
Bên cạnh những ưu điểm, phương pháp nuôi cấy mô TBTV còn có những nhược
điểm:
- Chi phí sản xuất cao: chi phí hóa chất, trang thiết bị hiện đại, tiêu tốn nhiều
năng lượng… nên giá thành sản xuất của cây giống cao so với các phương pháp
truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.
- Chất lượng cây giống có thể bị biến dị: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác
với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ
được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân
giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng
các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm
đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền. [4]
1.1.5. Các phương pháp nuôi cấy mô TBTV
Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm :
- Cấy cây : nuôi cấy cây con và cây lớn hơn
- Cấy phôi : gồm nuôi cấy các phôi cô lập đã trưởng thành và chưa trưởng thành
- Cấy cơ quan : cấy các cơ quan thực vật tách rời
- Cấy mô hoặc mô sẹo : cấy các loại mô tách ra từ một phần nào đó của một
cơ quan thực vật
- Cấy tế bào và huyền phù tế bào : cấy các tế bào cô lập hoặc cụm tế bào rất
nhỏ trong môi trường lỏng
- Cấy tế bào trần : cấy teé bào trần thực vật là nuôi cấy những tế bào không
có thành (vách) được dùng trong kỹ thuật di truyền
- Cấy túi phấn (thể đơn bội) : cấy túi phấn hoặc những hạt phấn chưa trưởng
thành để thu được tế bào đơn bội hay mô sẹo trong kỹ thuật di truyền.[3]

hoặc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên.
Nhìn chung sự tạo mô sẹo invitro (nhờ auxin tác động) do 3 quá trình:

8
- Sự phản phân hóa tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan) bao gồm
các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi.
- Sự phân chia của các tượng tầng: các tế bào tượng tầng của phần lớn STD dễ
dàng phân chia dưới tác động của auxin thấm chí không cần auxin ngoại sinh như ở
các loài cây cỏ hay dây leo.
- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) quá trình này được
ưu tiên áp dụng ở ĐTD (đơn tử diệp), vì các cây này tượng tầng thiếu và nhu mô
khó phản phân hoá so với STD (song tử diệp). Màu sắc của mô sẹo không giống
nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác nhau và
chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh…
Nồng độ và loại kích thích tố sử dụng trong môi trường nuôi cấy là những yếu
tố có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo. Thường mô sẹo được hình
thành trên môi trường giàu auxin; có thể dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với nhau
hoặc có thể kết hợp với cytokinin tuỳ từng loại cây.
Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của các hormon này trong
mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo. Vì vậy nguồn mẫu cấy, việc lấy
mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát sinh
mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy.[16]
1.1.5.3. Nuôi cấy bao phấn và túi phấn.
Nuôi cấy bao phấn và túi phấn tạo cây đơn bội là nhờ sự cảm ứng phát sinh
phôi từ những lần phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các tiểu bao tử, các hạt
phấn non. Giai đoạn phát triển đặc thù cảu bao phấn tại thời điểm nuôi cấy là nhân
tố quan trọng nhất đối với sự thành công của phát sinh phôi
Thực vật hạt kín, mỗi chồi hoa có thể chứa các bao phấn ở các giai đoạn
khác nhau. Vì vậy mỗi chồi hoa phải kiểm tra để xác định tất cả các giai đoạn phát
triển giúp lựa chọn những bao phấn có độ tuổi phù hợp cho nuôi cấy.

…) và các chất điều hòa sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng
và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường
mới.
Dối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đôi với nuôi
cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ ở dạng acid
amine, có đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa sinh

10
trưởng có vai trò quan trọng hơn vì mô tách rời không có khả năng tổng hợp chất
này. [4]
1.1.5.6. Nuôi cấy tế bào đơn
Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể
được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp. Những công trình về nuôi cấy
tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX.
Tế bào đợn có thể ghi nhân bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý bằng
enzyme. Mỗi loiạ cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy
khác nhau.
Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu
ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên quá trình sinh trưởng, phát triển và phân
hóa của tế bào. Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào.[4]
1.1.6. Môi trường nuôi cấy mô TBTV
Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết
cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây.
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực
vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục
đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như
MS (Murashige&Skoog, 1962) , LS (Linsmainer và Skoog, 1965)… Môi trường
MS (Murashige&Skoog, 1962) là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong
nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá
mầm, 2 lá mầm. Môi trường Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên

2
PO
4

-
và HPO
4

2-
còn
có tác dụng như một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trường trong
quá trình nuôi cấy.
- Kali ( K): K
+
là một cation chủ yếu trong cây,giúp cho cây cân bằng các
anion vô cơ và hữu cơ. Ion K được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có hai vai
trò chính là điều hòa pH và áp suất môi trường nội bào. Sự thiếu hụt K
+
trong môi
trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thừa nước và làm giảm tốc độ
hấp thu photphate. Người ta cung cấp Kali cho mô nuôi cấy dưới dạng kali nitat
(KNO
3
), kali clorua (KCl) và kalihydrophotphat (KH
2
PO
4
) [3]
- Canxi (Ca): Ca có mặt rất nhiều trong vách tế bào và màng tế bào. Sự có mặt
của Ca

vai trò quan trọng trong việc tổng hợp ATP. Mg được cung cấp dưới dạng magiê
sunphat ( MgSO
4
.7H2O)
- Sắt (Fe): Nhưng môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng FeCl
2
,
FeCl
3
.6H
2
O, FeSO
4
.7H
2
O, Fe
2
(SO
4
)
3
, Fe(C
4
H
4
O
6
). Hiện nay hầu hết các phòng
phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na
2

kích thích sự tăng trưởng tế bào đa số loài thực vật.[4]
Các vitamin khác như biotine, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid,
vitamin E … cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy.
Inositol cũng được đề cập tới như một loại vitamin có tác dụng kích thich sự
sinh trưởng và phát triển của cây một cách đáng kể.[13]
1.1.6.5. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác
Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các aminoacid cần thiết nhưng sự
bổ sung các aminoacid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của
tế bào. Việc sử dung amino acid đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào và tế bào
trần. Amino acid cung cấp cho thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của
tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ.[3]
Các nguồn nitrogen thường sử dụng trong nuôi cấy mô TBTV là hỗn hợp amino
acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine và adnine.

14
1.1.6.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các chất hữu cơ có bản chất hóa học
khác nhau được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ quan, bộ phận nhất
định của cây để điều hòa hoạt động sinh lý cũng như quá trình sinh trưởng và phát
triển của cây nhằm duy trì mối quan hệ hài hòa giữa các cơ quan, các bộ phận trong
cơ thể thực vật.
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật tham gia vào quá trình phân chia tế bào,
phân hóa các mô, phát sinh phôi, tác dụng lên chức năng của DNA và RNA làm ảnh
hưởng mạnh đến những quá trình chủ yếu của hoạt động sống thực vật như quá
trình sinh tổng hợp các enzyme, hô hấp, dinh dưỡng rễ, quang hợp … Chính vì vậy
chúng có tác dụng điều hòa sinh trưởng phát triển của cây. Các chất điều hòa sinh
truỏng bao gồm những chất sau:
a.Auxin
Auxin là chất điều hòa sinh trưởng được nghiên cứu đầu tiên với việc xác
định cấu trúc hóa học đầu tiên vào năm 1934. Auxin là chất xúc tác cho sự sinh

Cytokine được phát hiện trong quá trình nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật
vào năm 1945-1955. Nhưng đến năm 1965, Miller mới tách được chất hoạt tính
sinh học này với tên gọi là kinetin, sau đó mới xác định được cấu trúc hóa học của
nó. Cytokine là chất điều hòa sinh trưởng thực vật có tác dụng đẩy mạnh sự sinh
trưởng của cây trồng.[6]
Cytokinine có khả năng kích thích sự phân chia tế bào, tính đặc hiệu của nó
là kích thích quá trình phân bào giảm nhiễm. Bên cạnh đó cytokinine có vai trò
quan trọng trong quá trình phân hóa tế bào và tạo mới các cơ quan. Để thực hiện
được quá trình phân hóa tế bào và tạo mới các cơ quan thì cytokinine phải kết hợp
với auxin hoặc giberelin. Nếu vắng mặt auxin hoặc giberelin thì quá trình phân hóa
tế bào và tạo mới các cơ quan sẽ không hiệu quả auxin thúc đẩy quá trình nhân đôi
DNA và cytokinine cho phép tách rời các nhiễm sắc thể. [6]
Trong nuôi cấy mô tế bào thực, cytokinine đẩy mạnh quá trình hình thành
chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo. Cytokinine rất có hiêu quả trong vai trò

16
kích thích tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên
mô thực vật nuôi cấy invitro.
Một tỉ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinine sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh
hình thái mẫu cấy, khi nồng cytokinine cao hơn nồng độ cytokinine thì kích thích sự
tạo chồi và ngược lại nồng độ auxin cao hơn cytokinine thì kích thích sự tạo rễ.
Nồng độ cytokinine cao thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ đồng thời cũng ngăn
cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin.
Đại diện chính của cytokinine là kinetine được phát hiên trong dịch thủy
phân nấm men. Đặc trưng nhất của chất này là ngăn cản sự mất màu của lá trong
tối, tăng cường sự xâm nhập của dòng chất dinh dưỡng và thúc đẩy sự phân chia tế
bào khi nuôi cấy tế bào rời.
Trong nhóm cytokinine còn bao gồm các chất thường được sử dụng phổ biến
trong nuôi cấy mô: BA (6-benzylaminopurin) và TDZ (1-phenyl 3-(1-2,3 thiadiazol-
5yl) urea); Zeatine

bào động vật với nồng độ thích hợp.
Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1- 1%) hoặc
bột chuối với hàm lượng 40g bột tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan
nuôi cấy.
c. Agar
Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hoá
môi trường. Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6- 10%, đây là loại tinh bột đặc chế
từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu O
2

nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh
d. Than hoạt tính
Thường được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản
phẩm trao đổi chất thứ cấp Trong trường hợp những chất đó có tác dụng gây ức
chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Mặt khác, khi bổ sung vào môi trường, than
hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do môi trường trở nên sẫm vì vậy có thể
kích thích quá trình tạo rễ, một số trường hợp còn có tác dụng thúc đẩy phát sinh
phôi vô tính và kích thích sinh trưởng phát sinh cơ quan ở các loài cây gỗ. Tuy

18
nhiên, than hoạt tính lại làm giảm hiệu quả của các chất điều hoà sinh trưởng. Nồng
độ than hoạt tính thường sử dụng từ 0,2 - 0,3 % (w/v).
1.1.7. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.1.7.1. Giai đoạn chuẩn bị
Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là phải tạo ra nguồn nguyên liệu thực
vật vô trùng để đưa vào môi trường nuôi cấy. Khâu đầu tiên của giai đoạn này có
thể coi như một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy.
Cây giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi
trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ
động nguồn mẫu trong công tác nhân giống. Trong trường hợp cần thiết có thể làm