NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC VI KHUẨN CÓ TIỀM NĂNG
PHÂN HỦY TINH BỘT VÀ PROTEIN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ
NƯỚC
THẢI CHẾ BIẾN
LƯƠNG
THỰC VÀ THỦY SẢN
TÓM TẮT
Từ nƣớc thải sản xuất của một vài nhà máy chế biến nông sản (nui) và thủy sản
(tôm, cá), 12 chủng vi khuẩn khác nhau bao gồm 6 chủng có khả năng phân giải tinh bột
mạnh nhất và 6 chủng có khả năng phân giải protein tốt nhất đã
đƣợc
phân lập, lựa chọn
cho các thử nghiệm tiếp theo. Dựa vào các kết quả về đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh
hóa chuyên biệt thu nhận
đƣợc
kết hợp với khóa phân loại của Bergey, các chủng phân
lập và lựa chọn đều thuộc chi Bacillus. Kết quả ứng dụng riêng biệt mỗi chủng trên để
xử lý nƣớc thải chế biến nông sản và thủy sản cho thấy sau 24 giờ phối trộn trên máy
lắc với tỉ lệ trộn giống và nƣớc thải là 1% (về thể tích), hiệu quả xử lý đạt
đƣợc
là cao
nhất, khiến nồng độ chất hữu cơ (COD) trong
nƣớc
thải đầu vào giảm 76-88% đối với
nƣớc thải sản xuất nui và giảm 60 – 70% đối với nƣớc thải chế biến tôm cá. Đặc biệt,
hiệu quả xử lý chất hữu cơ khi phối hợp các chủng với nhau đều tăng lên so với khi chỉ
sử dụng một chủng riêng rẽ, đạt tới gần 90% với nƣớc thải chế biến nông sản và gần
80% với nƣớc thải chế biến thủy sản. Ngoài ra, công nghệ xử lý có bổ sung thêm chế
phẩm sinh học đã đƣợc tuyển chọn nêu trên còn góp phần giảm thiểu ô nhiễm vi sinh
vật gây bệnh bằng việc loại bỏ đến 92,5%
lƣợng

số chất khác (Nguyễn Đức
Lƣợng
và Nguyễn Thị Thùy
Dƣơng,
2003). Các chất hữu cơ cao phân tử
này do chậm phân hủy nên chính là tác nhân khiến nguồn
nƣớc
bị ô nhiễm nặng nề. Để giảm thiểu ô
nhiễm, bên cạnh các phƣơng pháp xử lý hóa học, hóa lý, cơ học thì phƣơng pháp xử lý sinh học
đƣợc coi là rất quan trọng và đem lại hiệu quả cao do đặc trƣng ô nhiễm chất hữu cơ có thể phân
hủy sinh học trong nƣớc thải chế biến nông sản thực phẩm. Trong số các vi khuẩn hoại sinh hiện
diện trong
nƣớc
thải, phần lớn các nhóm chỉ có khả năng hấp thụ và sử dụng các cơ chất ở dạng dễ
tan và đơn giản sẵn có trong môi
trƣờng.
Trong khi đó, một số nhóm khác lại có khả năng tổng hợp
và
đƣa
vào môi
trƣờng
các enzyme ngoại bào để phân giải các hợp chất hữu cơ cao phân tử thành
các đơn phân tử dễ tan hơn và dễ hấp thụ hơn để làm nguồn dinh dƣỡng. Tuy nhiên, không phải
chủng vi khuẩn nào cũng có thể tổng hợp đủ enzyme ngoại bào cần thiết để phân giải các cơ chất
hữu cơ trong nƣớc thải (Lƣơng Đức Phẩm et al., 2009). Do đó việc nghiên cứu và tập hợp các
chủng vi khuẩn có hiệu lực phân hủy chất hữu cơ cao
đƣợc
tuyển chọn từ nguồn bên ngoài với các
1
chủng tự nhiên có sẵn trong nƣớc thải các cơ sở chế biến nông sản, thực phẩm đóng vai trò quan

Phƣơng
Đông
Các tính chất ô nhiễm của 2 loại
nƣớc
thải trên
đƣợc
trình bày ở bảng 1
dƣới
đây:
Bảng 1. Các tính chất ô nhiễm của
nƣớc
thải thủy sản và tinh bột
Thông số Đơn vị
Nồng độ trung bình
Nhà máy thủy sản số 4 Công ty
Phƣơng
Đông
BOD
5
mg/l 2394 4888
COD mg/l 4160 8840
SS mg/l 352 467
pH mg/l 6.3 4,4
N tổng mg/l 30 40,47
P tổng mg/l 3 4,55
Coliform MPN/100ml 150 x 10
5
210 x 10
2
Thiết bị dụng cụ và hóa chất

Tiến hành
tƣơng
tự đối với mẫu
nƣớc
thải lấy từ hai cơ sở sản xuất nui trên TpHCM trên môi
trƣờng N1 (g/100ml) có 0,5g peptone, 0,2g cao nấm men, 1g tinh bột tan, 0,015g CaCl
2
, 0,05g
MgSO
4
và 2% agar, tiến hành ủ ở 37
o
C và cấy ria đến khi thuần nhất các khuẩn lạc thu
đƣợc.
Xác
định khả năng phân hủy tinh bột trên môi
trƣờng
chứa tinh bột tan với thuốc thử Lugol.
Xác định đặc điểm hình thái, sinh hóa
Các chủng vi sinh vật đƣợc xác định hình thái, nhuộm gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm khả
năng di động, catalase, nitrate, Indol, Methyl red, VP, citrate, nitrate. So sánh với khóa phân loại
Bergey để
bƣớc
đầu xác định nhóm vi khuẩn.
Xác định thời gian tăng
trƣởng
tối
ƣu
Nuôi cấy các chủng vi sinh vật phân lập
đƣợc

dƣ
bằng Fe(NH
4
)
2
(SO
4
)
2
với chỉ thị feroin.
- Nhu cầu oxy sinh hóa (BOD
5
): theo phƣơng pháp đo lƣờng sự chênh lệch về hàm lƣợng
DO
trong mẫu ủ tại hai thời điểm ban đầu và sau 5 ngày ủ ở 20
o
C trong bóng tối.
- Chất rắn lơ lửng:
Phƣơng
pháp khối
lƣợng.
- N tổng: theo các phƣơng pháp tƣơng ứng để xác định nồng độ N thành phần, bao gồm
N- Kjeldahl, N-NO
2
-
, N-NO
3
-
.
- P tổng: xử lý mẫu sau đó xác định bằng

Các chủng phải là vi khuẩn gram
dƣơng
nhằm loại bỏ các tác nhân gây bệnh trong
nƣớc
thải - phần
lớn là vi khuẩn gram âm. Đặc biệt quan tâm các vi khuẩn thuộc chi Bacillus vì đã có nhiều công
trình nghiên cứu về hệ enzyme protease và amylase phong phú của chi vi khuẩn này (Ajayi et al.,
2007; Sharmin và Rahman, 2007; Siriporn Yossan et al., 2006).
Từ mẫu
nƣớc
thải nhà máy thủy sản, phân lập
đƣợc
20 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển
trên môi
trƣờng
M1 chứa protein là nguồn carbon duy nhất. Từ mẫu
nƣớc
thải cơ sở sản xuất nui,
phân lập đƣợc 25 chủng phân lâp đƣợc trên môi trƣờng N1 với nguồn carbon từ tinh bột. So
sánh
với công trình của Hà Thanh Toàn và đồng tác giả (2008) đã phân lập
đƣợc
17 chủng vi khuẩn phân
giải protein, 21 chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ nƣớc rỉ rác Cần Thơ; công trình của
Thippeswamy và đồng tác giả (2006) cũng đã phân lập
đƣợc
17 chủng Bacillus từ đất và
nƣớc
thải
công nghiệp có khả năng xử lý tinh bột thì số lƣợng các chủng phân lập đƣợc dựa vào hình thái

catalse dƣơng tính, so với tài liệu phân loại vi khuẩn của Bergey (1957), đây đều là các chủng vi
khuẩn thuộc chi Bacillus. Một số tính chất sinh hóa của 12 chủng
đƣợc
trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Đặc điểm sinh hóa của 12 chủng vi khuẩn phân lập
6 chủng phân hủy protein
Chủng
M1 M2 M3 M4 M5 M6
6 chủng phân hủy tinh bột
N1 N2 N3 N4 N5 N6
Di động + + + + + +
+ + + + + +
Indol - - - - - -
- - - - - -
Metyl red + + + + + +
+ + + + + +
Voges-p - - - - - -
- - - - - -
Citrate + + + + + +
+ + + + + +
Ureas - - - - - -
- - - - - -
Lipase + + + + + +
+ + + + + +
Nitrate + + + + + +
+ + + + + +
Glucose + + + + + +
+ + + + + +
Lactose + + - + + +
+ - - - - -

của M6 là 1,408.
Bảng 3. Biến động giá trị OD của 6 chủng M1 – M6 theo thời gian
Giá trị OD
Chủng
18h 24h 26h 28h 30h 32h 34h 48h
M 1
1,29
1,32
1,31 1,30 1,29 1,27 1,10 1,10
M 2
1,06 1,12 1,22 1,30 1,39
1,48
1,24 1,11
M 3
1,31
1,35
1,34 1,30 1,21 1,22 1,21 1,22
M 4
1,37
1,39
1,38 1,36 1,35 1,33 1,20 1,21
M 5
1,22 1,22 1,37 1,38
1,41
1,36 1,15 1,09
M 6
1,37
1,41
1,36 1,34 1,34 1,29 1,11 1,10
Hình 3. Sự tăng


ến động g i

á t

r ị O D của 6 ch ủ ng N 1 – N 6 t heo t

h ờ

i g i

an
Giá trị OD
Chủng
18h 24h 26h 28h 30h 32h 34h 48h
N1
1,53
1,97
1,93 1,92 1,93 1,90 1,35 1,10
N2
1,10 1,40 2,10
2,67
2,72 2,66 1,87 1,22
N3
0,86 1,18 1,35
1,83
1,81 1,86 1,50 1,01
N4
1,37
1,89

đƣợc khoáng hóa. Đối với
nƣớc
thải giàu tinh bột
nhƣ nƣớc
thải sản xuất nui mà sự thay đổi của
nồng độ COD trong
nƣớc
thải có bổ sung các chủng vi sinh phân giải tinh bột
tƣơng
ứng đã phân
lập đƣợc (N1 – N6) trƣớc đó theo thời gian thể
hiện trên các hình 6a, 6b, 6c, tốc độ
khoáng hóa các hợp chất hữu cơ trong
loại nƣớc thải này còn nhanh hơn
100.0%
80.0%
Tỉ lệ 1% Tỉ lệ 2% Tỉ lệ
3%
nƣớc thải thủy sản, với nhiều mẫu mà
COD giảm rất nhanh tới 88% chỉ sau
24 giờ phối trộn với giống vi sinh vật.
Trong khi đó, ở mẫu đối chứng là mẫu
nƣớc thải đƣợc lắc ở cùng điều kiện
với các mẫu khác nhƣng không bổ
sung chủng vi sinh tuyển chọn từ
ngoài vào thì nồng độ COD chỉ giảm
60.0%
53.6%
55.2%
40.0%

3%
enzyme amylase và protease đã đƣợc
chứng minh ở thử nghiệm đo đạc
đƣờng
kính vòng phân giải các cơ chất
tƣơng ứng (hình 2) chính là nguyên
nhân thúc đẩy hoạt lực bùn hoạt tính,
giúp tăng cƣờng phân giải các chất
hữu cơ trong nƣớc thải đƣợc nhanh
hơn và hoàn toàn hơn. Một số thử
80.0%
60.0%
40.0%
20.0%
0.0%
45.6%
76.0%
56.8%
55.2%
63.2%
56.8%
39.2%
nghiệm tiến hành ở Việt Nam về khả
năng phân giải nhanh chất hữu cơ khi
bổ sung chế phẩm có Bacillus vào các
loại nƣớc và nƣớc thải khác nhau (Võ
Thị Thứ et al., 2005; Trần Liên Hà và
Đặng Ngọc Sâm, 2006; Mai Thị Hằng
et al., 1999) đều khẳng định hiệu quả
M1 M2 M3 M4 M5 M6 Đối

42.4%
76.0%
52.0%
53.6%
50.4%
53.6%
39.2%
bình lên 48 giờ và 72 giờ thì hiệu quả
loại bỏ COD của đa số các mẫu nƣớc
thải thủy sản cũng nhƣ nông sản đều giảm đi hoặc
không hầu nhƣ không
Hi
ệu
qu
ả
loạ
i
bỏ
C
O
D
sa
u
24
gi
ờ
(%
Hi
ệu
qu

M6 Đối
chứng
Nước thải thủy sản có bổ sung 1-3% các
chủng
M1-M6
Hình 5c. Hiệu quả xử lý
nƣớc
thải thủy sản (xét theo COD) của
các chủng M1 – M6 ở các tỉ lệ 1% - 3% sau 72 giờ cấy giống
đổi. Đó cũng chính là thời điểm khi hàm lƣợng chất dinh dƣỡng trong bình đã cạn kiệt, sự sinh
trƣởng
của vi sinh vật sẽ chậm dần và dần tiến đến đình trệ, khi đó chúng chết và tự thủy phân bởi
chính các enzyme do chúng giải phóng ra (Nguyễn Thành Đạt, 2005), khiến nồng độ các chất hữu
cơ trong
nƣớc
thải lại có xu
hƣớng
tăng lên và dẫn đến hiệu quả xử lý giảm đi.
Một điều đáng chú ý là đối với từng chủng riêng rẽ đƣợc bổ sung vào hai loại nƣớc thải với
các tỉ lệ giống thay đổi, các kết quả xử lý quan sát thấy ở tỉ lệ 1% hầu hết đều cao hơn ở các tỉ lệ
còn lại (1,5%; 2% và 3%). Kết quả này
cũng khá
tƣơng
đồng với kết quả nghiên
cứu của Ngô Tự Thành (2009) khi ứng
dụng vi sinh phân lập từ các mẫu đất ở
các vùng địa lý khác nhau để xử lý nƣớc
thải sông Tô Lịch (Hà Nội) với hai tỉ lệ
chế phẩm khác nhau thì hiệu quả xử lý
của mẫu có tỉ lệ chế phẩm thấp lại lớn

Trong nƣớc thải tồn tại rất nhiều
N1 N2 N3 N4 N5 N6 Đối
chứng
Nước thải sản xuất nui có bổ sung 1-2% các chủng
N1-N6
Hình 6a. Hiệu quả xử lý
nƣớc
thải sản xuất nui (xét theo COD)
của các chủng N1 – N6 ở các tỉ lệ 1% - 2% sau 24 giờ cấy giống
100.0%
84.0%
Tỉ lệ
1%
loại vi sinh vật khác nhau. Hoạt động
sống của chúng dựa trên quan hệ cộng
sinh (hoặc hội sinh) của toàn bộ quần
thể sinh vật có trong
nƣớc.
Chúng có tác
dụng hỗ trợ nhau trong sự phát triển và
phân hủy các chất hữu cơ trong môi
trƣờng. Một số vi sinh vật, để tổng hợp
tế bào mới và gia tăng sinh khối, ngoài
việc phân hủy cơ chất, chúng cũng có
80.0%
60.0%
40.0%
20.0%
0.0%
76.0% 72.0% 76.0%

sản, hỗn hợp các chủng M2 và M5 cũng
nhƣ hỗn hợp M1, M3, M4 và M6 đƣợc
hình thành dựa trên sự tƣơng đồng về
80.0%
60.0%
40.0%
20.0%
0.0%
80.0%
76.0%
72.0%
75.0% 76.0%
Tỉ lệ
1%
Tỉ lệ
1,5%
Tỉ lệ
2%
56.0%
hiệu quả xử lý nƣớc thải sau cùng một
Hi
ệu
qu
ả
loạ
i
bỏ
C
O
D

O
D
sa
u
72
gi
ờ
(%
khoảng thời gian (với M2 và M5 là sau
48 giờ, với M1, M3, M4 và M6 là sau
24 giờ), còn hỗn hợp 6 chủng từ M1 đến
N1 N2 N3 N4 N5 N6 Đối
chứng
Nước thải sản xuất nui có bổ sung 1-2% các chủng
N1-N6
Hình 6c. Hiệu quả xử lý
nƣớc
thải sản xuất nui (xét theo COD)
của các chủng N1 – N6 ở các tỉ lệ 1% - 2% sau 72 giờ cấy
M6 là sự trộn lẫn của tất cả 6 chủng phân
lập và chọn lọc từ
nƣớc
thải giàu protein.
Đối với
nƣớc
thải chế biến nui, cứ 1 đến
2 chủng trong số 3 chủng mạnh (N1, N4,
N5) đƣợc phối hợp với 2 đến 1 chủng
trong số 3 chủng yếu hơn (N2, N3, N6),
đồng thời hỗn hợp 6 chủng cũng đƣợc

sinh ở trên, thí nghiệm xác định hiệu quả
loại bỏ BOD và Coliform tổng trong
mẫu nƣớc thải thủy sản ban đầu cũng
đƣợc tiến hành. Kết quả cho thấy trong
nƣớc thải sau xử lý, nồng độ BOD đã
giảm đƣợc 67% (từ 260mg/L giảm còn
85,8mg/L) và mật độ Coliform đã giảm
tới 92,5% (từ 120.10
5
MPN/100ml giảm
còn 9.10
5
MPN/100ml).
Hình 7a. Hiệu quả xử lý
nƣớc
thải thủy sản (xét theo
COD)
của 1% tổ hợp các chủng
tƣơng
ứng sau 24 - 72 giờ cấy
giống
Hình 7b. Hiệu quả xử lý
nƣớc
thải sản xuất nui (xét theo
COD)
của 1% tổ hợp các chủng
tƣơng
ứng sau 24 - 72 giờ cấy
giống
Qua hình 7b, các mẫu

giảm đƣợc 80% và trong nƣớc thải sản xuất nui giảm đƣợc 94%, cải thiện rõ rệt so với khi chỉ sử
dụng hệ vi sinh vật sẵn có trong
nƣớc
thải (chất hữu cơ chỉ giảm
đƣợc
40-50%) ứng với cùng thời
gian xử lý. Các điều kiện thích hợp cho quá trình xử lý cũng đã
đƣợc
xác lập: tỉ lệ bổ sung chủng vi
sinh vào
nƣớc
thải là 1% (về thể tích), pH trung tính, thời gian xử lý (dạng mẻ) dao động từ 48 giờ
đến 72 giờ. Những kết quả ban đầu này có thể đƣợc coi là tiền đề để tiếp tục mở rộng quy mô
Hiệ
u
quả
loại
bỏ
COD
sau
các
khoả
ng
thời
nghiên cứu và thử nghiệm các tổ hợp vi sinh vật tuyển chọn đối với
nƣớc
thải chế biến nông thủy
sản nói riêng và
nƣớc
thải chứa các cơ chất khó phân hủy hơn nói chung.

nƣớc
thải. Tạp chí Khoa học Đại học quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ
25: 101-106.
Nguyễn Đức Lƣợng và Nguyễn Thị Thùy Dƣơng (2003) Công nghệ sinh học môi trƣờng – tập 1:
công nghệ xử lý
nƣớc
thải. NXB Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh.
Nguyễn Thành Đạt (2005) Cơ sở sinh học vi sinh vật – tập 1. NXB Đại học
Sƣ
phạm.
Sharmin F and Rahman M (2007) Isolation and characterization of protease procing Bacillus strain
FS-1. Agricultural Engineering International - the CIGR Ejournal 9: 289-297.
Siriporn Yossan, Alissara Reungsang and Masaaki Yasuda (2006) Purification and characterization
of protease from Bacillus megaterium isolated from Thai fish sauce fermentation process.
Science Asia 32: 377-383.
Thippeswamy S, Girigowda K, and Mulimani VH (2006) Isolation and identification of α-amylase
producing Bacillus sp. from dhal industry waste. Indian Journal of Biochemistry & Biophisics
43: 295-298.
Trần Liên Hà và Đặng Ngọc Sâm (2006) Phân lập và tuyển chọn Bacillus để xử lí nƣớc hồ bị ô
nhiễm. Hội nghị Khoa học lần thứ 20 - Kỷ niệm 50 năm thành lập
trƣờng
Đại học Bách khoa Hà
Nội, trang 55-58.
Trung tâm sản xuất sạch Việt Nam (2009) Tài liệu
hƣớng
dẫn sản xuất sạch hơn cho ngành sản xuất
tinh bột sắn. Nguồn: (Website của Trung tâm
sản xuất sạch Việt Nam)
Võ Thị Thứ, Trƣơng Ba Hùng, Nguyễn Minh Dƣơng, La Thị Nga, Lê Thị Thu Hiền, Phạm Thị
Minh Hà, Lê Doanh Toại, Nguyễn