Phân lập vi khuẩn khử sulphate (SRB) để ứng
dụng trong xử lý nước thải axit từ hoạt động
khai thác khoáng sản Nguyễn Thị Hải

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS chuyên ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: TS. Đinh Thúy Hằng
Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Nghiên cứu Acid Mine Drainage (AMD) và các vấn đề môi trường liên quan.
Xử lý AMD bằng phương pháp hóa học, sinh học. Đặc tính sinh học của Sulfate reducing
bacteria (SRB). Phân bố của SRB trong tự nhiên. Đa dạng về di truyền của SRB. Đặc
điểm sinh lý của SRB. Nhu cầu dinh dưỡng của SRB. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh
trưởng của SRB. Cạnh tranh của SRB với các nhóm vi khuẩn khác trong môi trường.
Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng SRB mới phân lập. Thử nghiệm xử lý
AMD trên mô hình phòng thí nghiệm.

Keywords: Sinh vật học; Nước thải axit; Vi khuẩn; Xử lý nước thải; Phân lập vi khuẩn Content
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 AMD (Acid Mine Drainage) và các vấn đề môi trƣờng liên quan
1.1.1 Sự hình thành AMD
AMD (Acid Mine Drainage) được hình thành khi các khoáng sulfide (như pyrite, FeS
2
)

1.1.2.3. Tình trạng ô nhiễm do AMD ở Việt Nam
Theo báo cáo Đánh giá môi trường chiến lược Quy hoạch phát triển ngành than đến năm
2020, có xét đến năm 2030, các mối nguy hại do ô nhiễm nước thải từ các mỏ than thuộc Tập
đoàn Công nghiệp than và Khoáng sản đã được đặt ra ở mức báo động.
Dựa trên số liệu kê khai nộp phí bảo vệ môi trường đối với nước thải công nghiệp của các
đơn vị thuộc ngành than, tổng lượng nước thải từ mỏ năm 2009 là 38.914.075 m
3
. Tuy nhiên con
số này chưa thể phản ánh đầy đủ thực trạng vì chưa thể tính được lượng nước rửa trôi từ các bãi
thải mỏ.
2011).
1.2 Xử lý AMD
1.2.1 Xử lý AMD bằng phƣơng pháp hóa học
Các chất hóa học thường được sử dụng để xử lý AMD gồm CaCO
3
, Ca(OH)
2
, Na
2
CO
3
, NaOH và
NH
3
.
Tuy phương pháp hóa học được sử dụng từ lâu và có hiệu quả nhanh chóng nhưng tốn kém và
không an toàn, thường gây ra những vấn đề ô nhiễm thứ cấp (Skousen và cs, 1996).
1.2.2. Xử lý AMD bằng phƣơng pháp sinh học
1.2.2.1. Cơ sở khoa học của công nghệ
Vi khuẩn khử sulfate (SRB) là các vi khuẩn sinh trưởng kỵ khí, sử dụng sulfate làm chất nhận

1.3. Đặc tính sinh học của SRB
SRB là vi khuẩn hô hấp kỵ khí, sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng để oxy hóa các
hợp chất hữu cơ đơn giản và hydro. SRB phổ biến trong môi trường kỵ khí, nơi chúng có vai trò
quan trọng trong cả chu trình lưu huỳnh và chu trình cacbon (hình 1.2).

Hình 1.2. Vị trí của SRB trong chu trình cacbon và lưu huỳnh (Muyzer, Stams, 2008).
1.3.3. Đặc điểm sinh lý của SRB
1.3.3.1. Nhu cầu dinh dƣỡng của SRB
Hầu hết SRB có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản và sinh trưởng tốt trong môi trường có nguồn
cacbon/năng lượng ổn định (Postgate, 1984). Nguồn cacbon và điện tử thích hợp đối với SRB
bao gồm các axit hữu cơ mạch ngắn như acetate, lactate, pyruvate và rượu (Hao và cs, 1996
Phụ thuộc vào cách oxy hóa chất hữu cơ mà SRB có thể được phân chia thành hai nhóm
trao đổi chất như sau (Widdel, 1988):
 Nhóm oxy hóa không hoàn toàn: oxy hóa các hợp chất hữu cơ đến acetate. Thuộc nhóm
này chủ yếu là các loài thuộc chi Desulfovibrio spp.
 Nhóm oxy hóa hoàn toàn: Oxy hóa các hợp chất hữu cơ (bao gồm cả acetate) hoàn toàn
thành CO
2.
. Trong nhóm này có đa dạng các loài SRB khác nhau, như Desulfobacter
spp., Desulfobacterium spp., Desulfosarcina spp.
SRB thực hiện trao đổi chất oxy hóa các cơ chất hữu cơ sử dụng sulfate làm chất nhận
điện tử cuối cùng (Postgate, 1984). Sự khử sulfate thành sulfide tiêu thụ 8 điện tử và các quá
trình sinh hóa thông qua nhiều bước trung gian với sự tham gia của nhiều enzyme (hình 1.4)
(Fauque và cs, 199; Kremer, Hansen, 1988).

Hình 1.4. Các bước khử sulfate ở SRB và các enzyme tham gia
Phản ứng có thể được tóm tắt như sau (Peck và Lissolo, 1988):
SO
4
2

cấy theo tỷ lệ 10% thể tích. Qua mỗi lần cấy truyền, số lượng SRB trong mẫu được tăng lên.
Phân lập SRB. Mẫu làm giàu lần 4 được dùng để phân lập SRB. Việc phân lập được tiến hành
theo phương pháp pha loãng trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) với môi trường có thành phần
tương tự môi trường dùng trong làm giàu (Widdel, Bak, 1992). Ống thạch bán lỏng sau khi bổ
sung nguồn vi sinh vật (10%) từ mẫu làm giàu được sục khí N
2
và ủ ở tư thế đảo ngược tại 30
o
C
trong bóng tối. Khuẩn lạc đơn phát triển trong các ống pha loãng được tách bằng pipet Pasteur và
chuyển sang môi trường dịch thể.
2.2.2 Xác định điều kiện sinh trƣởng tối ƣu
Nhiệt độ.
pH.
Độ muối.
Chất cho điện tử
Chất nhận điện tử
2.2.3. Tách DNA tổng số từ mẫu môi trƣờng và chủng thuần khiết
DNA tổng số của mẫu làm giàu và các mẫu thí nghiệm xử lý AMD trên mô hình được tách chiết
theo phương pháp do Zhou và cộng sự (1996)
2.2.4. Phƣơng pháp điện di biến tính DGGE

Hình 2.1. Vị trí đoạn gen 16S rDNA được sử dụng trong phân tích DGGE ở Lactobacillus
plantarum (Lopez và cs, 2003).
2.2.5. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại
Gen 16S rDNA (1500 bp) của các chủng SRB thuần khiết được khuếch đại trong phản ứng
PCR sử dụng cặp mồi 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) và 1492R
(GGTTACCTTGTTACGACT T) ( Weisburg và cs, 1991)
2.2.6. Phân tích hóa học
2.2.6.1. Định lƣợng Fe(II) bằng thuốc thử phenanthrolin (DIN 38406 E1-1, 1983)

Nguồn AMD: Nguồn AMD được thu thập từ mỏ than Tràng Khê ở Quảng Ninh có các đặc điểm lý hóa
như sau: pH = 4
Nồng độ sắt = 200 mg/l (tương đương 3,57 mM)
Nồng độ sulfate = 1320 mg/l (tương đương 13,75 mM)
Giá thể: Phoi bào được lót dưới lớp đáy của bể xử lý
Nguồn vi sinh vật: Dịch làm giàu SRB sau lần cấy truyền thứ 4 (E1-4)
Chu trình xử lý:

Hình 2.2. Mô hình xử lý AMD trong phòng thí nghiệm. 1) Bể điều hòa chứa AMD đầu vào; 2) Bể xử lý
AMD bằng SRB; 3) Bể lắng chứa nước thải đầu ra.
Mô hình xử lý AMD được hoạt động với nguồn cơ chất cho SRB sinh trưởng được bổ sung từ
bên ngoài là methanol hoặc nước thải có hàm lượng hữu cơ cao.

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Làm giàu và phân lập vi khuẩn khử sulfate (SRB) từ các mẫu nƣớc thải

Hình 3.1. Hàm lượng sulfide của các mẫu làm giàu ở lần cấy truyền thứ 4
Trên cơ sở đó, E1-4 được sử dụng để tiến hành phân lập các chủng SRB thuần khiết.
0
2
4
6
8
10
12
E1-4 E2-4 E3-4
Nồng độ sulfide (mM)
1
2
3

SR4
Hình đĩa lồi 2
mặt, màu đen
Hình phẩy khuẩn, kích thước 1×2-3
μm (hình 3.3)
Chuyển động
nhanh Hình 3.3. Hình thái tế bào của ba chủng SRB thuần khiết phân lập được từ mẫu dịch làm giàu
với nước thải
3.2. Vị trí phân loại của ba chủng SRB dựa trên trình tự gen 16S rDNA
SR2 SR3 SR4

Hình 3.6. Cây phân loại neibourgh joining dựa trên trình tự gen 16S rDNA gần đủ của các chủng
SRB mới phân lập so sánh với các loài SRB có quan hệ gần gũi. Escherichia coli (-
Proteobacteria) được chọn làm outgroup.
3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng SRB mới phân lập
3.3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ muối trong môi trƣờng

Nồng độ sulfide OD
600

SR2
0
1
2
3
4
5

4
5
0 1 5 10 15 20 25
Nồng độ muối (g/l)
Nồng độ sulfide(mM)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
OD600
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường tới mức tăng sinh và hoạt tính khử
sulfate của các chủng SRB mới phân lập.
3.3.2. Ảnh hƣởng của pH trong môi trƣờng

Nồng độ sulfide OD
600

Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH tới mức tăng sinh và hoạt tính khử sulfate của các chủng SRB mới
phân lập.
Nhằm mục đích lựa chọn nguồn SRB phù hợp nhất cho xử lý AMD, chúng tôi đã tiến
hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới hỗn hợp ba chủng SRB mới phân lập so với mẫu dịch
làm giàu gốc của ba chủng này (hình 3.9).

Nồng độ sulfide OD
600

Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH đối với hỗn hợp chủng SRB và mẫu làm giàu gốc (E1-4)
3.3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy
Hỗn hợp 3 chủng

0.2
0.3
0.4
OD600
SR2
0
1
2
3
4
4 5 6 7 8
pH
Nồng độ sulfide (mM)
0
0.1
0.2
0.3
OD600
SR3
0
1
2
3
4
4 5 6 7 8
pH
Nồng độ sulfide (mM)
0
0.1
0.2

Lacte
+++
+++
+++
Acetate
+
+

Methanol
+
+
++
Chất nhận điện tử (để
oxy hóa lactate)
Sulfate
+++
+++
+++
Nitrate
+++

+++
Fe (III)


++
Chú thích: +++ sinh trưởng tốt; ++ sinh trưởng trung bình; + sinh trưởng kém;  không sinh
trưởng.
3.4. Thử nghiệm xử lý AMD trên mô hình phòng thí nghiệm
Bảng 3.3. Tóm tắt thí nghiệm xử lý AMD trên mô hình phòng thí nghiệm

quy mô 3 – 5 lít (hình 3.11)
SR2
0
1
2
3
4
5
15 20 25 30 37
Nhiệt độ (oC)
Nồng độ sulfide (mM)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
OD600
SR3
0
1
2
3
4
5
15 20 25 30 37
Nhiệt độ (oC)
Nồng độ sulfide (mM)
0
0.1
0.2

12
16
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Thời gian (ngày)
Nồng độ sulfate
(mM)
0
2
4
6
8
10
pH
Nồng độ sulfate pH
Mô hình 2
0
4
8
12
16
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Thời gian (ngày)
Nồng độ sulfate
(mM)
0
2
4
6
8
10

4. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý của 3 chủng thấy rằng:
 Cả 3 chủng đều có khả năng sinh trưởng tốt ở môi trường có hàm lượng muối 10 – 15
g/l, tương ứng với môi trường nước lợ. Đặc biệt là chủng SR4 có thể sinh trưởng tốt
tại nồng độ muối 25 g/L, tương đương môi trường nước biển.



SR3
SR2
SR4

*
*
SR2: Desulfomicrobium sp.
SR3: Desulfobulbus sp.
SR4: Desulfovibrio sp.
**

 Cả ba chủng đều bị ức chế tại pH môi trường  6, tuy nhiên mẫu làm giàu gốc E1-4
thể hiện khả năng chịu pH thấp tốt hơn các chủng thuần khiết và sinh trưởng tốt ở pH
4 và 5.
5. Mô hình thử nghiệm xử lý AMD với cơ chất bổ sung là nước thải có hàm lượng hữu cơ cao
đạt hiệu quả cao hơn khi sử dụng cơ chất đơn là methanol. Kết quả thu được sau 7 ngày xử lý
gồm: pH tăng từ 4 lên 8,15, nồng độ sulfate giảm từ 13,75 mM còn 4,5 mM, hàm lượng sắt
giảm từ 200 mg/l còn 36 mg/l thể hiện khả năng ứng dụng thực tế của công nghệ.

References
Tiếng việt
1. Công ty cổ phần tin học, công nghệ, môi trường, TCT Than & Khoáng sản Việt Nam
(2012), Kết quả phân tích nước thải mỏ than.

treatment systems for leachate discharges in Western Maryland, Presented at the American
Society for Surface Mining and Reclamation 17th

Annual Meeting, Tampa, Florida, June
11-15, 2000.
14. Brown M, Barley B, Wood H (2002), Minewater treatment: technology, application and
policy, IWA Publishing, London.
15. Brysch K, Schneider C, Fuchs G, Widdel F (1987), “Lithoautotrophic growth of sulphate-
reducing bacteria, and description of Desulfobacterium autotrophicum gen. nov., sp. nov.”,
Arch. Microbiol.,148, pp. 264–274.
16. Cabrera G, Pérez RJM, Gómez, Ábalos A, Cantero D (2006), “Toxic effects of dissolved
heavy metals on Desulfovibrio vulgaris and Desulfovibrio sp. strains”, J. Hazar. Mater.,
135, pp. 40-46.
17. Chaney RL, Brown SL, Angle JS, Stuczynski TI, Daniels WL, Henry CL, Siebielec G, Li
YM, Malik M, Ryan JA, Compton H (2000), In situ Remediation/ Reclamation/Restoration
of Metals Contaminated Soils using Tailor-Made Biosolids Mixtures, Symposium on
Mining, Forest and Land Restoration: The Successful Use of Residuals/Biosolids/Organic
Matter for Reclamation Activities, Denver, CO.
18. Cooper EL, Wagner CC (1973), “The effects of acid mine drainage on fish populations”,
Fish and Food Organisms in Acid Waters of Pennsylvania, US Environmental Protection,
EPA, pp. 32-114.
19. Cord-Ruwisch R (1985), “A quick method for the determination of dissolved and
precipitated sulfides in cultures of sulfate-reducing bacteria”, J. Microbiol. Meth. 4, pp.
33-36.
20. Dar SA., Kuenen JG, Muyzer G (2005), “Nested PCR-denaturing gradient gel
electrophoresis approach to determine the diversity of sulfate-reducing bacteria in complex
microbial communities”, Appl. Environ. Microbiol., 71, pp. 2325–2330.
21. Dar SA, Stams AJ, Kuenen JG, Muyzer G (2007), “Co-existence of physiologically similar
sulphate-reducing bacteria in a full-scale sulfidogenic bioreactor fed with a single organic
electron donor”, Appl. Microbiol. Biotechnol., 75, pp. 1463–1472.

Proceedings of the 23
rd
Annual West Virginia Surface Mine Drainage Task Force
Symposium, Morgantown, West Virginia, April 16-17, 2002.
35. Dinh TH, Kuever J, MaBmann M, Hassel AW, Martin Stratmann and Friedrich Weddel, “Iron
corrosion by novel anaerobic microorganism”, Nature, 427, pp. 829-832.
36. Hao OJ, Chen JM, Huang L, Buglass RL (1996), “Sulphate reducing bacteria”, Crit. Rev.
Enviro. Sci. Technol., 26, pp. 155-187.
37. Hao OJ, Huang L, Chen JM, Buglass RL (1994), “Effects of metal additions on sulphate
reduction activity in wastewaters”, Toxicology and Environmental Chemistyi, 46, pp. 197-
212.
38. Higgins JP, Hard BC, Mattes A (2003), Bioremediation of rock drainage using sulphate-
reducing bacteria, Proceedings of Sudbury 2003: Mining and Environment, Sudbury,
Ontario, May 25-28, 2003.
39. Hill RD (1974), Mining impacts on trout habitat, Proceedings of a Symposium on Trout
Habitat, Research, and Management, Boone, NC, Appalachian Consortium Press.
40. Hilton BL, Oleszkiewiez JA (1988), “Sulfide induced inhibition of anaerobic digestion”, J.
Environ. Eng., 114, pp. 1377–1391.
41. Hines ME, Evans RS, Genthner BRS, Willis SG, Friedman S, Rooney-Varga JN, Devereux
R (1999), “Molecular phylogenetic and biogeochemical studies of sulfate-reducing bacteria
in the rhizosphere of Spartina alterniflora”, Appl. Environ. Microbiol., 65, 2209–2216.
42. Howells GD, Brown DJA, Sadler K (1983), "Effects of acidity, calcium, and aluminum on
fish survival and productivity - a review", J. Sci. Food Agr., 34(6), pp. 559-570.
43. Itoh T, Suzuki KI, Nakase T (1998), “Thermocladium modestius gen. nov., sp. nov. a new
genus of rod-shaped, extremely thermophilic crenarchaeote”, Int. J. Syst. Bacteriol., 48, pp.
879–887.
44. Itoh T, Suzuki KI, Sanches PC, Nakase T (1999), “Caldivirga maquilingensis gen. nov., sp.
nov. a new genus of rod-shaped crenarchaeote isolated from a hot spring in the
Philippines”, Int. J. Syst. Bacteriol., 49, pp. 1157–1163.
45. Jage CR, Zipper CE, Hendricks AC (2000), Factors affecting performance of Successive

propionicus”, FEMS Microbiol. Lett., 49, pp. 273-277.
55. Laanbroek HJ, Geerligs HJ, Sijtsma L, Veldkamp H (1984), “Competition for sulfate and
ethanol among Desulfobacter, Desulfobulbus, and Desulfovibrio species isolated from
intertidal sediments”, Appl. Environ. Microbiol., 47, pp. 329–334.
56. Logan MV, Reardon KF, Figueroa LA, McLain JET, Ahmann DM (2005), “Microbial
community activities during establishment, performance, and decline of bench-scale
passive treatment systems for mine drainage”, Water Res., 39, pp. 4537-4551.
57. Lopez IFR, Larrea L, Cocolin

E, Orr T, Phister M, Marshall J, Gheynst V, Mills DA (2003),
“Design and evaluation of PCR primers for analysis of bacterial populations in wine by
denaturing gradient gel electrophoresis”, Appl. Environ. Microbiol., 69, pp. 6801–6807.
58. Maillacheruvu KY, Parkin GF (1996), “Kinetics of growth, substrate utilization and sulphide
toxicity for propionate, acetate and hydrogen utilisers in anaerobic systems”, Water
Environ. Res., 68, pp. 1099–1106.
59. Marmur J (1961), “A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from
microorganisms”, J Mol Biol, 3, pp. 208-218.
60. McCartney DM, Oleszkiewicz JA. (1991), “Sulphide inhibition of anaerobic degradation of
lactate and acetate”, Water Res., 25, pp. 203–209.
61. McCartney DM, Oleszkiewicz JA (1993), “Competition between methanogens and sulphate
reducers: effect of COD: sulphate ratio and acclimation”, Water Environ. Res., 65, pp.
655–664.
62. Menendez R (1978), “Effects of acid water on Shavers Fork – a case history”, Surface
mining and fish/wildlife needs in the Eastern United States., U.S. DOI, Fish and Wildlife
Service, pp. 160-169.
63. Minz D, Flax JL, Green SJ, Muyzer G, Cohen Y, Wagner M, Rittmann EB, Stahl DA
(1999), “Diversity of sulfate-reducing bacteria in oxic and anoxic regions of a microbial
mat characterized by comparative analysis of dissimilatory sulfite reductase genes”, Appl.
Environ. Microbiol. 65, pp. 4666–4671.
64. Munshower FF, Neuman DR, Jennings SR, Phillips GR (1997), “Effects of land reclamation

76. Pfennig N, Widdel F, Truper HG (1981), “The dissimilatory sulphate reducing bacteria”, in
The Prokaryotes, 2, pp. 926-940.
77. Postage JR (1984), The sulphate reducing bacteria, 2
nd
ed, Cambridge Univertsity Press,
Cambridge.
78. Ramsing NB, Kühl M, Jørgensen BB (1993), “Distribution of sulfate-reducing bacteria, O
2
,
and H
2
S in photosynthetic biofilms determined by oligonucleotide probes and
microelectrodes”, Appl. Environ. Microbiol., 59, pp. 3840–3849.
79. Ravenschlag K, Sahm K, Knoblauch C, Jørgensen BB, Amann R. (2000), “Community
structure, cellular rRNA content, and activity of sulfate-reducing bacteria in marine Arctic
sediments”, Appl. Environ. Microbiol., 66, pp. 3592–3602.
80. Reis MAM, Almeida JS, Lemos PC, Carrondo MJT (1992), “Effect of hydrogen sulphide on
growth of sulphate-reducing bacteria”, Biotechnol. Bioeng., 40, pp. 593–600.
81. Rissati JB, Capman WC, Stahl DA (1994), “Community structure of a microbial mat: the
phylogenetic dimension”, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91, pp. 10173–10177.
82. Rodríguez L, Ruiz E, Alonso-Azcárate J, Rincón, J (2009), “Heavy metal distribution and
chemical speciation in tailings and soils around a Pb–Zn mine in Spain”, J. Environ.
Manag., 90 , pp. 1106-1116.
83. Rose AW, Alcorn GS, Phelps LB, Bower PR (2001), Case study of Pot Ridge Passive
Treatment Systems, Cambria County, Pennsylvania, Presented at the American Society for
Surface Mining and Reclamation 18
th
Annual National Meeting, Albuquerque, New
Mexico, June 3-7, 2001.
84. Saitou N, Nei M (1987), “The neighbor-joining method: a new method for reconstructing

methanogenic consortia and anaerobic respiring bacteria”, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.,
81, pp. 31–56.
96. Stephenson SL, Studiar SM, McQuattie CJ (1995), “Effects of acidification on bryophyte
communities in West Viginia moutain streams”, J. Environ. Qual., 24, pp. 116 – 125.
97. Teitzel GM, Parsek MR (2003), “Heavy metal resistance of biofilm and planktonic
Pseudomonas aeruginosa”, Appl. Environ. Microbiol., 69, pp. 2313–2320.
98. Thauer RK, Jungermann K, Decker K (1977), “Energy conservation in chemotrophic
anaerobic bacteria”, Bacteriol. Rev., 41, pp. 100-180.
99. Tsukamoto TK, Killion HA, Miller GC (2004), “Column experiments for microbial treatment
of acid mine drainage: low-temperature, low-pH and matrix investigations”, Water Res.,
38, pp. 1405-1418.
100. U.S.Department of Agriculture (USDA) and EPA Region III (2000), A Handbook of
Constructed Wetlands, Report# 843F00003.
101. U.S.Department of Energy (US DOE) (1998), Research and Application of Permeable
Reactive Barriers, Document# K0002000.
102. US EPA (2004a), Nationwide Identification of Hardrock Mining Sites, Report #2004-P-
00005, Office of the Inspector General.
103. US EPA (2004b), Abandoned Mine Lands Team Reference Notebook.
104. Vega FA, Covelo EF, Andrade ML (2006), “Competitive sorption and desorption of heavy
metals in mine soils: Influence of mine soil characteristics”, J. Colloid Interface Sci., 298,
pp. 582-592.
105. Warner RW (1971), "Distribution of biota in a stream polluted by acid mine drainage",
Ohio J. Sci., 71, pp. 202-215.
106. Watzlaf G, Schroeder K, Kleinmann R, Kairies C, Nairn R (2003), “The passive treatment
of coal mine drainage”, US Department of Energy NETL, pp. 72.
107. Wawer C, Jetten MS, Muyzer G (1997), “Genetic diversity and expression of the NiFe
hydrogenase large-subunit gene of Desulfovibrio spp. in environmental sample”, Appl.
Environ. Microbiol., 61, pp.4360–4369.
108. Webster G, Watt LC, Rinna J, Fry JC, Evershed RP, Parkes RJ, Weightman AJ (2006), “A
comparison of stable isotope probing of DNA and phospholipids fatty acids to study