BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC
VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED
WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.)
VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY
NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO
MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2002-2006
Sinh viên thực hiện: VĂN NGỌC DUNG
Thành phố Hồ Chí Minh


Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN VĂN NGỌC DUNG
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2006 iii
LỜI CẢM TẠ Con xin kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, người đã sinh thành, dưỡng
dục để con có được ngày hôm nay. Các em đã, đang và sẽ cùng chị chia sẻ những vui
buồn trong cuộc sống.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí
Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo nhiều thuận lợi học tập
cho em trong suốt bốn năm đại học.
Em xin cám ơn Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh -
Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh cùng các anh chị tại Trung tâm đã tạo
điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp.
Vô cùng biết ơn PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt
những kinh nghiệm quý báu cho em để em có thể hoàn tất khóa luận tốt nghiệp.
Trân trọng cám ơn TS. Bùi Minh Trí cùng Quý Thầy - Cô trong và ngoài trường
đã hết lòng truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em trong suốt thời gian học tập.
Xin chân thành cảm ơn chị Hưng, chị Hà, anh Vũ, anh Trường, chị Hạnh, chị
Dương đã sẵn lòng giúp đỡ để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này.
Cảm ơn các bạn cùng lớp Công Nghệ Sinh Học K28, niên khóa 2002 – 2006, đã

TMV, CMV và TSWV.
Chọn mẫu dương tính với TMV thực hiện RT – PCR, với mục đích xây dựng
quy trình RT – PCR chẩn đoán TMV, nhằm khẳng định lại kết quả ELISA.
Kết quả thu được:
Chưa phát hiện được TSWV trên thuốc lá và đậu phộng tại các huyện thu thập
mẫu ở tỉnh Tây Ninh.
Thuốc lá tại Tây Ninh nhiễm TMV với tỷ lệ khá cao (69,1%). Trong đó,
huyện Tân Biên nhiễm TMV là chủ yếu (69,2%) và ở Bến Cầu là CMV (60,6%).
Kỹ thuật RT – PCR bước đầu đã khuếch đại được đoạn gen đặc trưng của
TMV với kích thước 1000 bp. Điều này đã cho thấy rằng dòng TMV gây bệnh
trên thuốc lá tại Việt Nam đã biến đổi so với các dòng virus khác. v
MỤC LỤC

PHẦN TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục v
Danh sách các chữ viết tắt x
Danh sách các hình xi
Danh sách các bảng xii
Danh sách các biểu đồ xiii

1. MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích – Yêu cầu 2
1.2.1 Mục đích 2

2.3.3 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây đậu phộng 13
2.4 Giới thiệu về Tomato Spotted Wilt Virus 14
2.4.1 Nguồn gốc và sự lan truyền của TSWV 15
2.4.2 Cấu trúc của virus TSWV 15
2.4.3 Phân loại TSWV 15
2.4.4 Dãy ký chủ của TSWV 16
2.4.5 Con đường truyền bệnh 16
2.4.6 Điều kiện phát triển bệnh 17
2.4.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TSWV 17
2.4.8 Khống chế bệnh do TSWV 20
2.5 Giới thiệu về Tobacco Mosaic Virus 20
2.5.1 Nguồn gốc của TMV 20
2.5.2 Cấu trúc của virus TMV 21
2.5.3 Phân loại TMV 21
2.5.4 Dãy ký chủ của TMV 21
2.5.5 Con đường truyền bệnh 21
2.5.6 Điều kiện phát triển bệnh 22
2.5.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TMV 22
2.5.8 Khống chế bệnh do TMV 24
vii
2.6 Giới thiệu về Cucumber Mosaic Virus 24
2.6.1 Nguồn gốc của CMV 24
2.6.2 Cấu trúc của virus CMV 24
2.6.3 Phân loại CMV 24
2.6.4 Dãy ký chủ của CMV 25
2.6.5 Con đường truyền bệnh 25
2.6.6 Điều kiện phát triển bệnh 26

2.13.1 Những nghiên cứu trên thế giới 36
2.13.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam 36
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 37
3.2 Phương pháp lấy mẫu 37
3.3 Dụng cụ 37
3.4 Phương pháp chẩn đoán TMV, CMV và TSWV bằng dDAS – ELISA 38
3.4.1 Hóa chất 38
3.4.2 Phương pháp thực hiện 38
3.4.2.1 Ly trích mẫu 38
3.4.2.2 Thực hiện phản ứng ELISA 38
3.5 Phương pháp chẩn đoán TMV bằng RT – PCR 40
3.5.1 Hóa chất 40
3.5.2 Phương pháp thực hiện 41
3.5.2.1 Ly trích RNA 41
3.5.2.2 Khuếch đại bằng RT – PCR 42
3.5.2.3 Đổ gel điện di 43
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45
4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA 45
4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TSWV trên đậu phộng tại huyện Dương Minh Châu
và Bến Cầu 45
4.1.2 Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV và TSWV trên thuốc lá thu thập tại
huyện Tân Biên và Bến Cầu 46
4.1.3 Tỷ lệ nhiễm CMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu 47
4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu 48
4.1.5 Tỷ lệ chỉ nhiễm CMV hay chỉ nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp
CMV và TMV trên số mẫu thu thập được 50
4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát được trên cây thuốc lá 51
4.2 Kết quả RT – PCR 55


ssRNA : Single strand RNA
Ta : Annealing temperature
TAE : Tris Acetate Ethylendiaminetetraacid acetic
Taq : Thermus aquaticus
Tm : Melting temperature
TMV : Tobacco Mosaic Virus
TSWV : Tomato Spotted Wilt Virus
UV : Ultra violet xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1 Nicotiana tabacum L. 3
Hình 2.2 Một số hình ảnh về cây thuốc lá Nicotiana tabacum L. 6
Hình 2.3 Arachis hypogaea L. 7
Hình 2.4 Một số hình ảnh về cây đậu phộng Arachis hypogaea L. 10
Hình 2.5 Cấu trúc virus TSWV 15
Hình 2.6 Bọ trĩ trưởng thành dài 1 mm 17
Hình 2.7 Triệu chứng nhiễm TSWV trên một số thực vật 19
Hình 2.8 Cấu trúc virus TMV 21
Hình 2.9 Triệu chứng nhiễm TMV trên thực vật 23
Hình 2.10 Cấu trúc virus CMV 25
Hình 2.11 Triệu chứng nhiễm CMV trên một số thực vật 28
Hình 4.12 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Bến Cầu 53
Hình 4.13 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Tân Biên 54
Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện
Tân Biên 56
Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện

xiii
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

BIỂU ĐỒ TRANG
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ số mẫu thuốc lá dương tính, âm tính với CMV, TMV, TSWV 46
Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV giữa Tân Biên và Bến Cầu 47
Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm TMV giữa Tân Biên và Bến Cầu 48
Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ giữa các mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các
mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV 50
Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng trên lá 51

1
Phần 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và đậu phộng (Arachis hypogaea L.) là hai
trong số các loại cây trồng công nghiệp khá quan trọng. Chúng không những là mặt
hàng tiêu dùng phục vụ cho đời sống con người mà còn là nguồn thu ngân sách đáng
kể của nhiều quốc gia trên thế giới. Do lợi ích kinh tế đó, nên chúng đã được trồng tại
nhiều nơi trên thế giới và không ngừng được mở rộng diện tích.
Tại Việt Nam, việc trồng thuốc lá và đậu phộng cũng đem lại những giá trị nhất
định, về phương diện sử dụng lẫn phương diện thương mại, đóng góp một phần không
nhỏ vào tổng thu nhập quốc gia. Tuy nhiên, các loại bệnh cây cũng theo đó mà không
ngừng phát triển, tấn công cây trồng, và đã gây ra không ít tổn hại cho việc trồng trọt
và sử dụng, nhất là bệnh do virus gây nên. Hiện nay, với khoa học tiên tiến, sinh học
hiện đại đã phát hiện được trên 650 loài virus gây bệnh cho thực vật.

triệu chứng nhiễm TSWV ngoài đồng ruộng, tại các huyện trên địa bàn tỉnh Tây Ninh.
Nắm vững nguyên tắc và các bước tiến hành của kỹ thuật DAS – ELISA và RT –
PCR, sau đó mới tiến hành chẩn đoán. 3
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây thuốc lá
2.1.1 Vị trí phân loại
Ngành : Angiospermae
Lớp : Dicotyledones
Họ : Solanaceae
Tên khoa học : Nicotiana tabacum L.
Tên tiếng Anh : Tobacco
Tên tiếng Việt : Thuốc lá
2.1.2 Nguồn gốc và phân bố
Cây thuốc lá hoang dại đã có cách đây khoảng bốn ngàn năm, trùng với nền văn
minh của người da đỏ vùng Trung và Nam Mỹ. Hàng ngàn năm trước Công nguyên,
người da đỏ đã trồng thuốc lá trên những vùng đất mênh mông ở Nam Mỹ, Trung Mỹ,
Mexico ở Bắc Mỹ, quần đảo Antille và một số nơi khác. Họ dùng thuốc lá với mục
đích nghi lễ và chữa bệnh.
Năm 1492, trong chuyến thám hiểm tìm ra châu Mỹ, Christophe Columbus đã
phát hiện thấy người bản xứ ở quần đảo Antille hút một loại lá cuốn tròn gọi là
Tabaccos. Không lâu sau đó, thuốc lá đã được phổ biến và gieo trồng khắp thế giới.
Vào những năm 1530 – 1600, cây thuốc lá được các giáo sĩ người Pháp đưa vào
Việt Nam.
2.1.3 Đặc điểm di truyền
Bộ nhiễm sắc thể 2n = 48.

C.
Độ ẩm không khí thích hợp cho cây thuốc lá: 70% 80%.
Độ ẩm đất thích hợp:
Giai đoạn đầu sinh trưởng: 60% 65%.
Giai đoạn sinh trưởng mạnh: 80%.
Giai đoạn già chín của lá: 60%.
2.1.5.2 Yếu tố đất đai
Cây thích hợp với đất nhẹ (đất pha cát hoặc đất cát), tơi xốp, thông thoáng tốt,
thoát nước dễ. Độ pH tốt nhất cho đất trồng thuốc lá ở thời kỳ đầu là pH = 6, hơi
kiềm ở thời kỳ sau là pH từ 7,5 đến 7,9.
Lượng phân bón cơ bản là: N: 40 – 80kg/ ha, P: 30 – 90kg/ ha và K: 50 –
110kg/ ha.
2.1.5.3 Yếu tố sinh vật
Cây dại, cây ký chủ, là thành phần gây hại đến sinh trưởng cây thuốc lá.
Động vật gây hại (trực tiếp, gián tiếp) cho cây thuốc lá ở nước ta có rất nhiều.
Tại miền Bắc Việt Nam, theo kết quả điều tra cho thấy có 40 loài sâu bệnh xuất
hiện và gây hại ở các vùng trồng thuốc lá. Trong đó có 9 loại bệnh do virus, 5 do vi
khuẩn, 12 loại bệnh nấm và 16 loại sâu.
2.1.6 Giá trị kinh tế và sử dụng 5
Lợi nhuận đối với người trồng thuốc lá rất cao. Sản phẩm chính của cây thuốc lá
là sản xuất ra các loại thuốc hút, nhai, ngửi.
Các bộ phận trên cây thuốc lá có tỷ lệ: Lá: 30%, thân: 40%, hạt: 20% và rễ: 10%.
Như thế, đối với các nước có nền công nghiệp chưa phát triển, thì việc sử dụng năng
suất sinh học còn rất thấp vì ngoài lá ra không tận dụng được các bộ phận còn lại để
sản xuất các sản phẩm khác.
Thành phần độc hại trong thuốc lá có nhiều, quá trình nhiệt phân, ngưng tụ trong
khi đốt, cháy (hút) đã tạo ra một số chất, ảnh hưởng sâu sắc đến hóa tính của lá thuốc.
(C)
(A)
(B)
(A): Vườn cây thuốc lá
Hình 2.2 Một số hình ảnh về cây thuốc lá Nicotiana tabacum L.
(D)
(E)
(F)

(B): Đặc điểm hình thái
(C), (D), (E), (F): Sự đa dạng về chủng loại và màu sắc
(


đến Nam Mỹ.
Trong số 25 nước trồng đậu phộng ở Châu Á, Việt Nam đứng hàng thứ 5, và đậu
phộng đã được trồng khá phổ biến từ xưa đến nay ở nhiều nơi.
2.2.3 Đặc điểm di truyền
Bộ nhiễm sắc thể: 2n = 40.
Hàm lượng DNA trong nhân tế bào: 4,31 × 10
-12
gram/ bộ nhiễm sắc thể.
Số cặp base trong bộ nhiễm sắc thể: 4,2 × 10
9
bp.

Hình 2.3 Arachis hypogaea L. 8
2.2.4 Đặc điểm hình thái
Đậu phộng có rễ cọc phát triển tốt. Rễ dạng bò khoẻ hơn dạng mọc đứng.
Đây là cây cỏ nhỏ, nhất niên, nhánh sà, có lông, chiều cao từ 20 – 40 cm.
Thân chính mọc từ đốt cuối của trụ trên lá mầm, hai lá mầm đối xứng nhau.
Có 4 hoặc 3 lá chét ( chỉ có ở Erectoides), hình dạng lá thay đổi từ thuôn, lưỡi
mác đến elip, elip thuôn dài, có lông bao phủ.
Hoa đậu phộng dạng cánh bướm, màu vàng, cánh rời, cây phát hoa ở nách lá,
các hoa ở gần mặt đất.
Quả hình thành dưới đất, thắt từ 1 – 5 đốt, mỗi đốt chứa 1 hạt với 2 lá mầm và
1 phôi thẳng. Bế quả có quả bì chạm trổ.
Hạt có vỏ lụa mỏng, đỏ, chiều dài 7 – 21 mm, đường kính 5 – 13 mm.
2.2.5 Đặc điểm trồng trọt
2.2.5.1 Yếu tố khí hậu
Cây sinh trưởng cần nhiều ánh sáng mặt trời và thời tiết ấm nóng.

chưa bão hòa giúp cải thiện độ ổn định của insulin đường máu.
Ngoài các chất chống oxy hóa ra thì đậu phộng có chứa nhiều thành phần dinh
dưỡng khác nên nó còn giúp ngăn ngừa bệnh tim nhờ làm giảm lượng cholesterol
trong máu.
Đậu phộng là một trong những cây xuất khẩu thu ngoại tệ của nước ta. Hiện nay,
ngoài những vùng chuyên canh, thì nó đã và đang được trồng khá phổ biến ở nhiều
vùng trong nước. Mặc dù có vai trò quan trọng như vậy, nhưng nghiên cứu cơ bản
cũng như nghiên cứu các ứng dụng về đậu phộng ở nước ta nhìn chung vẫn còn nhiều
hạn chế.
10
Virus thực vật không có cấu tạo tế bào, là những nucleoprotein kích thước rất nhỏ
bé, cấu tạo rất đơn giản: Là protein và acid nucleic mà chủ yếu là RNA. Tuy nhiên,
cũng có khoảng 25 loài virus chứa DNA.
Protein gồm nhiều loại acid amin tạo thành: Alanin, glycin, lizin, aginin, acid
asparaginic, acid glutamic, lesin, sistein, prolin, triptophan. Các acid nucleic (RNA
hay DNA) sẽ quyết định bản chất protein của chúng.
Trọng lượng cơ thể của virus rất khác nhau từ 4,6 triệu Da đến 39 triệu Da.
Chúng có nhiều hình dạng khác nhau: Hình gậy, hình cầu, hình sợi, hình tinh
trùng. Một số virus trong những điều kiện nhất định của môi trường có thể tạo thành
các tinh thể.
2.3.1.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật
Đa số virus di chuyển theo bó mạch libe từ trên xuống dưới rồi lại từ dưới lên
trên khi các dòng chất dinh dưỡng được vận chuyển về các cơ quan sinh thực. Virus di
chuyển từ tế bào này sang tế bào khác bằng các cầu nối nguyên sinh hết sức chậm
chạp, di chuyển trong các mô mạch dẫn có tốc độ nhanh hơn.
Các con đường truyền bệnh:
Truyền qua nhân giống vô tính: Ghép cây, ghép chồi, chiết cành, gốc ghép,
cành ghép, cành giâm, nuôi cấy mô thực vật hay nhân giống vô tính từ củ hay
thân cây.
Truyền qua hạt giống hay phấn hoa cây trồng: Có khoảng 100 loài virus có
khả năng này, phần lớn tập trung ở họ bầu bí.