Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ HOÀNG ĐỨC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN CHUỖI CHẾ TẠO
KIT PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A/H5N1 CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
MÃ SỐ: 60 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC


LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ
Hà Nội, Tháng 11-2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà
– Trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Phó viện trưởng Viện Công nghệ
sinh học đã định hướng nghiên cứu, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi
có thể hoàn thành luận văn này.
Tôi xin được cảm ơn TS. Lê Văn Sơn, Phó trưởng phòng Công nghệ
ADN ứng dụng và TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công nghệ Tế bào
thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình
thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ của ThS. Hoàng Hà cùng
tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thực vật và phòng Công nghệ ADN
ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã dành cho tôi trong suốt quá trình
làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Đào tạo, Ban lãnh đạo Viện Sinh thái &
Tài nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, các thầy cô giáo
đang công tác tại Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về virus cúm A 3
1.1.1. Giới thiệu về bệnh cúm 3
1.1.2. Cấu trúc chung của virus cúm A 3
1.1.3. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A 4
1.1.4. Lịch sử bệnh cúm A 6
1.1.5. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới và tại Việt Nam 7
1.1.6. Các phương pháp chẩn đoán virus cúm A/H5N1 10
1.2. Kháng thể đơn chuỗi và kỹ thuật phage display 11
1.2.1. Kháng thể 11
1.2.2. Kháng thể đơn chuỗi 12
1.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng của kháng thể đơn chuỗi 13
1.2.4. Kỹ thuật phage display 14
1.2.4.1. Giới thiệu chung về kỹ thuật phage display 14
1.2.4.2. Filamentous phage M13 14
1.2.4.3. Tạo thư viện phage display 16
1.3. Kỹ thuật ngƣng kết ứng dụng trong chẩn đoán 18
1.3.1. Hạt latex 19
1.3.2. Một số nghiên cứu ứng dụng hạt latex trong chẩn đoán 20
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Vật liệu 21
2.2. Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 23
2.2.1. Hóa chất 23
2.2.2. Thiết bị máy móc 27
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu 27
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 27
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
bp
: base pair
cDNA
: Complementary DNA
DNA
: Deoxirybonucleotide acid
E. coli
: Escherichia coli
EDAC
: 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide
EDTA
: Ethylenediaminetetraacetic acid
IPTG
: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Kb
: Kilo base
kDa
: Kilo Dalton
LB
: Luria-Bertani
OD
: Optical Density
PBS

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. (A) Các dạng hình thái của virus cúm A được nhuộm âm tính trên kính hiển vi điện
từ truyền qua. (B) Cấu trúc vủa virus cúm A 4
Hình 1.2. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của virus
cúm A 6
Hình 1.3. Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể 11
Hình 1.4. Các protein cấu thành virion của M13 15
Hình 1.5. Chu kỳ sống của phage M13 trong E. coli 15
Hình 2.1. Sơ đồ vector pTI2+/VH10 21
Hình 2.2. Quy trình gắn protein lên bề mặt hạt latex 33
Hình 3.1. Kết quả biến nạp vào tế bào E.coli HB 2151 38
Hình 3.2. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR dùng mồi đặc hiệu (pTI-NcoI-F và pTI-
NotI-R) từ dòng khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc. 38
Hình 3.3. Hình ảnh điện di protein tổng số của tế bào E. coli HB2151 mang gen mã hóa cho
các cấu trúc kháng thể đơn chuỗi VH10 40
Hình 3.4. Kết quả lai Western blot kiểm tra protein tổng số của tế bào E. coli HB2151 mang
vector pTI2+/VH10 với kháng thể anti polyhistidin. 41
Hình 3.5. Hình ảnh điện di protein VH10 được biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau. 42
Hình 3.6. Hình ảnh điện di protein VH10 được cảm ứng biểu hiện ở các nồng độ IPTG khác
nhau 43
Hình 3.7. Hình ảnh điện di protein VH10 được cảm ứng biểu hiện ở các thời gian
khác nhau 44
Hình 3.8. Hình ảnh điện di kiểm tra tính tan của protein VH10 45
Hình 3.9. Hình ảnh điện di protein VH10 sau khi tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực His-tag. 45
Hình 3.10. Phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên H5 với hạt latex được gắn với 100, 200
và 400 g kháng thể đơn chuỗi VH10. 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐẶT VẤN ĐỀ
Cúm gia cầm (Avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở mọi
loài chim, kể cả gia cầm và thủy cầm, do các phân type (subtype) của nhóm
virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên. Virus cúm
A được chia thành các phân nhóm dựa trên hai glycoprotein bề mặt là
hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). HA được chia thành 16 phân nhóm
(từ H1 đến H16) và NA được chia thành 9 phân nhóm (từ N1 đến N9). Trong số
16 phân nhóm của virus cúm A, các chủng trong phân nhóm H5 và H7 có thể
gây ra thể cúm gia cầm độc lực cao, có khả năng lây lan mạnh, tử vong nhanh
ở những loài lông vũ cảm nhiễm. Hầu hết các virus cúm gia cầm có ảnh
hưởng đến người thường gây ra các triệu chứng đường hô hấp nhẹ hoặc viêm
kết mạc mắt, trừ một ngoại lệ là chủng H5N1. Virus cúm A/H5N1 là thể độc
lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây bệnh nặng với tỷ lệ tử
vong cao ở người trong các vụ dịch diễn ra vào năm 1997 và năm 2003.
Theo số liệu của Tổ chức y tế thế giới (WHO), từ năm 2003 đến tháng 6
năm 2013 đã có 375 người tử vong do cúm gia cầm trong số 630 ca nhiễm
H5N1 tại 15 nước. Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 bắt
đầu xuất hiện từ những tháng cuối năm 2003, đã có 62 ca tử vong trong số 125

- Thử nghiệm chế tạo kit phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1 theo nguyên
lý ngưng kết miễn dịch.
Nội dung nghiên cứu:
- Nghiên cứu tối ưu các điều kiện biểu hiện kháng thể đơn chuỗi VH10 tái
tổ hợp ở E. coli và tinh sạch kháng thể đơn chuỗi VH10.
- Nghiên cứu chế tạo bộ kit phát hiện virus cúm A/H5N1 theo nguyên lý
ngưng kết miễn dịch.
- Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit phát hiện nhanh virus cúm
A/H5N1 và thử nghiệm bộ kit với các mẫu thực địa.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về virus cúm A
1.1.1. Giới thiệu về bệnh cúm
Bệnh cúm là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây theo đường hô hấp do virus
cúm gây ra. Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae bao gồm 4 nhóm: virus cúm
A (Influenza A virus), virus cúm B (Influenza B virus), virus cúm C (Influenza C
virus) và Thogotovirus. Trong đó:
Nhóm virus cúm A (Influenza A virus) thường gây nhiễm cho các loài
vật như cá voi, hải cẩu, gia súc, gia cầm và các loài chim di cư hoang dã, sau
đó tiếp xúc với con người và gây bệnh cho người [38].
Nhóm virus cúm B (Influenza B virus) thường gây nhiễm cho con người
và một số gây nhiễm cho loài hải cẩu.

protein trần hoặc đã được glycosyl hoá gắn chặt vào lớp kép lipid nhờ các tương
tác kỵ nước. Kích thước của những gai mấu có độ dài 10-14 nm, đường kính 4-6
nm. Có khoảng 500 gai mấu chia làm 2 loại: gai HA (hemagglutinin) và gai NA
(neuraminidase) [33], [17], [40], [42].
1.1.3. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A
Hệ gen của virus cúm A/H5N1 là RNA sợi đơn âm (ss(-)RNA) có độ
dài tổng số khoảng 13.500 ribonucleotide, bao gồm 8 sợi RNA riêng biệt, mã
hoá cho 11 protein khác nhau của virus. Các phân đoạn được sắp xếp theo
trật tự: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS
(NS1 và NS2) [54]. Trong đó:
A
B Số hóa bởi Trung tâm Học liệu Phân đoạn 1 mã hoá cho enzyme polymerase PB2 (polymerase basic
protein 2) là tiểu đơn vị của RNA transcriptase, chịu trách nhiệm khởi đầu
phiên mã [43].
Phân đoạn 2 mã hoá cho enzyme polymerase PB1 (polymerase basic
protein 1) là tiểu đơn vị xúc tác của RNA transcriptase [24].
Phân đoạn 3 mã hoá cho enzyme kéo dài phiên mã PA (polymerase
acidic protein 2) là tiểu đơn vị của RNA transcriptase, tham gia tổng hợp
RNA [24].
Phân đoạn 4 mã hóa cho hemagglutinin (HA), đ â y l à một kháng
nguyên bề mặt đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A, có vai trò
đặc biệt quan trọng trong quá trình gây nhiễm và góp phần rất lớn quyết định
tính gây bệnh của virus. Hemagglutinin là một glycoprotein có khả năng gây
ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA

Hình 1.2. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của virus
cúm A [78]
Trong quá khứ, virus cúm A đã gây ra hàng loạt các trận đại dịch đối với
con người như dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 do virus cúm A/H1N1, dịch
cúm châu Á năm 1957 – 1958 do virus cúm A/H2N2, dịch cúm Hồng Kông
năm 1968 do virus cúm A/H3N2.
Năm 1959, biến thể cúm A/H5N1 đầu tiên trên thế giới được phát hiện
gây bệnh trên gà tại Scotland. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu Năm 1996, virus cúm A/H5N1 xuất hiện trở lại và gây bệnh ở loài ngỗng
tại Quảng Đông, Trung Quốc.
Năm 1997, dịch cúm tại Hồng Kông do virus cúm A/H5N1 được ghi
nhận là lần đầu tiên virus này gây bệnh trên người [62].
Từ cuối năm 2003 đến nay, những đợt cúm gia cầm do virus cúm
A/H5N1 đã liên tiếp xảy ra ở 15 quốc gia trên toàn thế giới. Virus gây bệnh đã
được phân lập và định type, chủ yếu là chủng H5N1 có độc lực cao.
Tháng 6/2009, WHO đã công bố đại dịch cúm A/H1N1 trên toàn thế
giới.
Tháng 3/2013, dịch cúm do virus cúm A/H7N9 gây ra đã khiến 31 người
tử vong trong số 129 người mắc virus cúm này tại Trung Quốc.
1.1.5. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới và tại Việt Nam
Virus cúm A/H5N1 thuộc phân nhóm virus cúm gia cầm có khả năng
xâm nhiễm cao. Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây
bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959, đây là biến thể H5N1 đầu tiên
trên thế giới với danh pháp: A/Ck/Scotland/59 (H5N1) và có số đăng ký trong
Ngân hàng gen: X07869.

Năm
2010

Năm
2011

Năm
2012

Năm
2013

Tổng
số

M
C
M

C

M

C

M
C
M
C
M


0

2

0

3

0

1
1
7

1

Campuchia

9
7
1

1

8

8

3

30

Djibouti

1
0
0

0

0

0

0

0

0
0
1

0

Ai
Cập

90
27
29


7

0
0
192

160

I
rắc

3
2
0

0

0

0

0

0

0
0
3


0

0

0

0

0

0
0
1

0

Nigeria

1
1
0

0

0

0

0


Thái
Lan

25
17
0

0

0

0

0

0

0
0
25

17

Thổ Nhĩ
kỳ

12
4
0



2

2
1
125

62

Tổng
số

468
282
48

24

62

34

29

18

20
15
630


Nam có cùng nguồn gốc với virus cúm A/H5N1 ở Nam Trung Quốc và Hồng
Kông và đây cũng là virus cúm thuộc thế hệ mới có biến đổi cơ bản về gen H5
và gen N1[4], [5], [48], [57].
Trong những năm 2004 – 2006, các chủng virus cúm A/H5N1 tại Việt
Nam cũng đã được phân lập và nghiên cứu chi tiết về quan hệ phân tử với các
chủng trong vùng và thế giới. Các kết quả đã chỉ ra rằng, virus cúm A/H5N1
vùng Nam và Đông Nam Á thuộc clade VTM (viết tắt: Vietnam-Thailand-
Malaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhóm vùng
Trung Quốc và Hồng Kông [9], [27], [48].
Năm 2007, biến chủng H5N1 phân dòng Phúc Kiến (clade 2.3.4) đã
xuất hiện tại Việt Nam và đến nay xuất hiện clade 2.3.2, các biến chủng này có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu tỷ lệ tương đồng kháng nguyên H5 và N1 thấp so với các chủng phân dòng
Quảng Đông [2], [4].
Những nghiên cứu dịch tễ học phân tử, chẩn đoán, vector tái tổ hợp
dẫn truyền gen kháng nguyên sử dụng adenovirus hoặc virus Lasota và chuyển
gen vào thực vật cũng được tiến hành. Một số nghiên về tạo vaccine di truyền
ngược, vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và công
nghệ tái tổ hợp sản xuất chế phẩm kháng nguyên H5 trong thực vật và tế bào
cũng được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Thú y quốc gia, Viện
Di truyền Nông nghiệp và một số cơ sở nghiên cứu khác [1], [4], [8].
Các cơ sở y tế như Bệnh viện Nhi trung ương, Viện Vệ sinh dịch tễ
trung ương, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh cũng đã có một số nghiên cứu liên
quan đến cúm A/H5N1 trên người, song song với những nghiên cứu về cúm gia
cầm ở gia cầm. [15], [47], [13]. Những kết quả nghiên cứu trên đã và đang
làm sáng tỏ thêm về dịch tễ học phân tử, phát triển tiến hoá, genotype của

cơ sở y tế không được trang bị đầy đủ các thiết bị máy móc hiện đại.
1.2. Kháng thể đơn chuỗi và kỹ thuật phage display
1.2.1. Kháng thể
Kháng thể là một sản phẩm đặc hiệu được hệ miễn dịch tổng hợp giúp cơ
thể tấn công các tác nhân gây bệnh. Các kháng thể là các immunoglobulin (có
bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B, các tương bào (biệt hoá từ
lympho B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hoá các tác
nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus [11]. Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4
chuỗi polypeptide, gồm hai chuỗi nặng (H) giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ (L)
cũng giống hệt nhau (Hình 1.3).

Kháng thể đơn chuỗi
từ vùng biến đổi của
chuỗi nặng
Kháng thể đơn chuỗi
kết hợp từ vùng biến
đổi của chuỗi nặng và
chuỗi nhẹ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu Hình 1.3. Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể [71]
Chú thích: Fab: Vùng bám kháng nguyên; Fc: Vùng cố định; Fv: Vùng biến đổi;
scFv: Kháng thể đơn chuỗi kết hợp từ vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ
Chuỗi nhẹ có trọng luợng phân tử 25 kDa, chứa khoảng 211 – 221 axit
amin. Có hai loại chuỗi nhẹ là kappa (Қ) và lambda (λ). Mỗi phân tử Ig chỉ chứa
hoặc hai chuỗi nhẹ Қ hoặc hai chuỗi nhẹ λ mà không bao giờ chứa cả hai loại.
Mỗi chuỗi nhẹ của Ig chứa hai vùng axit amin: vùng biến đổi (V
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Các gen mã hóa cho chuỗi nặng và chuỗi nhẹ được khuếch đại từ tế bào
lympho B thông qua quá trình sao chép ngược và phản ứng PCR.
- Sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme giới hạn và được tách dòng. Sau đó
các gen đơn được nối với nhau bằng một mảnh DNA nối.
- Đoạn DNA mã hóa cho kháng thể đơn chuỗi sẽ được cài vào trong một
vector phagemid và phagemid tái tổ hợp này sẽ được biến nạp vào tế bào vi
khuẩn E. coli thông qua
phương pháp biến nạp bằng sốc nhiệt hay xung điện
[44], [45].
1.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng của kháng thể đơn chuỗi

Hiện nay, kháng thể đơn chuỗi scFv đã được ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh
vực. Năm 1999, Harper và cộng sự đã nghiên cứu đặc tính của kháng thể scFv
chống lại virus Potato leafroll trên khoai tây. Trong đó, scFv được gắn kết thêm
với các thành phần khác như C
L
hoặc AP nhằm tăng hiệu quả trong việc chống
lại virus Potato leafroll [36].
Năm 2003, kháng thể scFv tái tổ hợp đã được Brichta và cộng sự chế tạo
thành công với mục đích kháng lại axit 2,4-dichlophenoxyacetic (2,4-D) có
trong một số loại thuốc trừ cỏ [25].
Cheng Xinyao và cộng sự (2005) đã sản xuất kháng thể tái đơn chuỗi
scFv tái tổ hợp kháng Sunfoglucolipit, một hợp chất có nhiều trong các tế bào
gây ung thư. Những mảnh kháng thể scFv được tạo ra với kích thước nhỏ, dễ
dàng xâm nhập vào các mô khối u hơn so với các kháng thể tự nhiên và giúp

ra và cho thấy nhiều ưu điểm [20].
1.2.4.2. Filamentous phage M13
Trong kỹ thuật phage display, các phage hình sợi như filamentous
bacteriophage M13 và họ hàng gần của nó thường được dùng để bộc lộ các
peptide và protein. Phage hình sợi là một nhóm virus gây nhiễm vi khuẩn lớn, có
khả năng gây nhiễm nhiều vi khuẩn Gram âm khác nhau [20].
Virion M13 kiểu dại có đường kính 65 Å và dài 9300 Å (Hình 1.4).
Virion chứa hệ gen mạch đơn có độ lớn 6407 bp được bao bọc bởi lớp vỏ dài
dạng ống có bản chất là protein vỏ pVIII [65]. Một đầu của phage M13 được Số hóa bởi Trung tâm Học liệu bao phủ bởi 2 protein là pVII và pIX, đầu còn lại được bao phủ bởi protein pIII
và pVI. Ngoài các protein vỏ, M13 còn tạo ra 6 protein khác là pII, pX, pV, pI,
pIV, pXI [45].

Hình 1.4. Các protein cấu thành virion của M13 [61]
Chu kỳ sống của phage M13 bắt đầu bằng quá trình xâm nhiễm khi chúng
tiếp xúc với bề mặt vi khuẩn thông qua tương tác giữa protein pIII với F pilus
của E.coli [55]. Sau đó phage chuyển bộ gen của nó vào tế bào chủ và các
protein vỏ gắn với màng vi khuẩn. Bên trong vi khuẩn, nhờ các enzyme tổng
hợp của tế bào chủ mà bộ gen của phage được chuyển thành DNA dạng mạch
kép, tiếp theo sau quá trình này là quá trình tổng hợp 11 protein của phage M13
(Hình 1.5) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu