BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
***

TRỊNH MINH HỢP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP
CHUYỂN GEN ĐỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM
HIRSUTUM L.) KHÁNG SÂU XANH (HELICOVERPA
ARMIGERA HÜBNER)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH
2: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN
HÀ NỘI - 2012

i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, hình ảnh, kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực và
chưa từng được sử dụng để bảo vệ học vị nào. Các tài liệu trích dẫn được chỉ
rõ nguồn gốc và mọi sự giúp đỡ đã được cám ơn.

Hà Nội, ngày 06 tháng 6 năm 2012
Tác giả luận án Trịnh Minh Hợp


Trịnh Minh Hợp

iii
MỤC LỤC

Trang
Lời cam đoan
i
Lời cảm ơn
ii
Mục lục
iii
Ký hiệu và chữ viết tắt trong luận án
ix
Danh mục bảng trong luận án
xi
Danh mục hình trong luận án
xiv
MỞ ĐẦU ……………………………………………………………….
1
1. Tính cấp thiết của đề tài …………………………………………
1
2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ………………………
2
2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài …………………………………
2
2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài …………………………………
3
3. Mục đích và yêu cầu của đề tài …………………………………

9
1.2.2. Tổn thất do sâu hại bông và chi phí phòng trừ …………
11
1.3. Tình hình sản xuất, sử dụng bông chuyển gen và bông Bt kháng sâu
12
1.4. Ý nghĩa của trồng bông Bt kháng sâu …………………………
14
1.4.1. Tăng năng suất …………………………………………….
14
1.4.2. Giảm sử dụng thuốc trừ sâu ……………………………….
14
1.5. Sơ lược lịch sử khám phá gen Bt ……………………………….
16
1.6. Tái sinh cây bông
17
1.6.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma ………………
17
1.6.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi ………………….
22
1.7. Chuyển gen cây bông …………………………………………
23
1.7.1. Chuyển gen thông qua A. tumefaciens …………
24
1.7.2. Chuyển gen bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn
28
1.7.2.1. Cơ chế của chuyển gen PTP …………………………
28

v


1.8.3.1. Đánh giá hoạt động phiên mã của gen chuyển bằng
Northern blot …………………………………………
41
1.8.3.2. Đánh giá hoạt động dịch mã của gen chuyển bằng
Western blot ………………………………………….
42
1.8.4. Đánh giá tính kháng sâu của cây bông chuyển gen Bt ……
43

vi

Trang
Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
46
2.1. Vật liệu nghiên cứu ……………………………………………
46
2.1.1. Giống bông ………………………………………………
46
2.1.2. Gen, vector chuyển gen và chủng vi khuẩn ……………….
46
2.1.3. Cặp mồi đặc hiệu ………………………………………….
48
2.1.4. Hoá chất …………………………………………………
48
2.1.5. Máy móc, thiết bị ………………………………………….
49
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ………………………….
49
2.2.1. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens ……
49

60
3.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma …
60
3.1.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi ………………….
71
3.1.3. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens
78
3.1.3.1. Xác định thông số chuyển gen ……………………….
78
3.1.3.2. Thực hiện chuyển gen ……………………………….
84
3.2. Chuyển gen CryIAc vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy
qua đường ống phấn ……………………………………
90
3.2.1. Xác định thông số vi tiêm …………………………………
91
3.2.2. Vi tiêm tạo hạt chuyển gen thế hệ T
0
……………………
94
3.3. Sàng lọc, đánh giá cây bông chuyển gen ……………………….
97
3.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh ………….
97
3.3.1.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng hygromycin …
97
3.3.1.2. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kanamycin …….
100
3.3.2. Đánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR ………………
107

2. Đề nghị ……………………………………………………………
121
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CÓ
LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI …………………………………………….
122
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………….
123
PHỤ LỤC ………………………………………………………………
141 ix

DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTP
Deoxyribonucleotide triphosphate
ĐC, ĐC+ và ĐC-
Đối chứng, đối chứng dương và đối chứng âm
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
GA
3

Gibberellin A
3
gfp
Green fluorescent protein
gus
β-Glucuronidase
hpt
Hygromycin phosphotransferase
IAA
3-Indoleacetic acid
IBA
Indole-3-butyric acid
ICAC
International cotton advisory committee - Ủy ban cố
vấn bông quốc tế
ICP
Insecticidal crystal protein - protein tinh thể diệt sâu

x

PCR
Polymerase chain reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp
PE
Polyethylene
Picloram
4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid
PTP
Pollen tube pathway - đường ống phấn
RNA
Ribonucleic acid
SDS
Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
TDZ
Thidiazuron
TE
Tris - EDTA buffer
Tris-HCl
Tris hydrochloride: Tris(hydroxymethyl)aminomethane
hydrochloride
VIP3A
Vegetative insecticidal protein - protein sinh dưỡng diệt
côn trùng
Zeatin
6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)purine

xi
DANH MỤC BẢNG TRONG LUẬN ÁN
Bảng

Bảng 3.1.
Tỷ lệ và mức độ cảm ứng mô sẹo trên các môi trường CI
62
Bảng 3.2.
Mức độ lớn của mô sẹo trên môi trường CP
65
Bảng 3.3.
Tỷ lệ cảm ứng phân hóa phôi trên môi trường EI ……
66
Bảng 3.4.
Số lượng và tỷ lệ cây tái sinh hoàn chỉnh trong ống nghiệm
69
Bảng 3.5.
Tỷ lệ cây tái sinh sống ở các phương pháp huấn luyện,
trồng cây tái sinh ………………………………………

71
Bảng 3.6.
Tỷ lệ cảm ứng đa chồi của phôi hạt trên các môi trường MSI
72
Bảng 3.7.
Tỷ lệ tạo cụm chồi và số chồi/cụm trên các môi trường S
75
Bảng 3.8.
Tỷ lệ cây tái sinh ra rễ trên các môi trường R ……
77
Bảng 3.9.
Tỷ lệ cây tái sinh sống trong nhà kính và nhà lưới …
78
Bảng 3.10.

83
Bảng 3.14.
Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo và nhiễm A. tumefaciens ở 4
nhiệt độ đồng nuôi cấy

84
Bảng 3.15.
Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo, mô sẹo sống sót và phân hóa
phôi ở 3 đợt chuyển gen ……………………………….

86
Bảng 3.16.
Số cây tái sinh trong ống nghiệm, nhà kính, nhà lưới và
cây ra hoa - đậu quả bình thường ……………………

90
Bảng 3.17.
Tỷ lệ hoa nở ở các thời điểm trong ngày của 4 giống bông
92
Bảng 3.18.
Kích thước bầu nhụy, chiều dài trụ noãn và độ sâu kim
tiêm của 4 giống bông …………………………………

93
Bảng 3.19.
Số hoa vi tiêm, quả đậu và hạt chuyển gen thế hệ T
0
thu
được của 4 giống bông trên 3 nồng độ DNA plasmid …


2
giống Coker312 và SSR60F ……

100
Bảng 3.25.
Số lượng và tỷ lệ cây chuyển gen thế hệ T
1
, dòng
chuyển gen thế hệ T
2
kháng kanamycin ……….………

101
Bảng 3.26.
Tỷ lệ cây kháng kanamycin của 7 dòng chuyển gen thế
hệ T
2
giống LRA5166 …………………………………

105
Bảng 3.27.
Tỷ lệ cây kháng kanamycin của 64 dòng chuyển gen
thế hệ T
2
giống MCU9 …………………………

106
Bảng 3.28.
Tỷ lệ cây kháng kanamycin của 9 dòng chuyển gen thế
hệ T


113
Bảng 3.33.
Số dòng chuyển gen thế hệ T
2
kháng sâu cao, trung bình
và yếu

114
Bảng 3.34.
Tỷ lệ sâu chết và sống sót ở các tuổi khi ăn lá của 87
dòng chuyển gen thế hệ T
2 116
Bảng 3.35.
So sánh đặc điểm sâu sống sót khi ăn lá dòng chuyển
gen thế hệ T
2
và giống ĐC

119
xiv
DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN ÁN
Hình
Nội dung

Hình 3.9.
Đoạn thân nuôi trên môi trường CI
4
bổ sung hygromycin
ở 6 nồng độ

79
Hình 3.10.
Mô sẹo chuyển gen cảm ứng sau 3 tuần nuôi cấy trên
môi trường CI
4
bổ sung 12,5 mg/l hygromycin

85
Hình 3.11.
Nhân, chọn lọc mô sẹo; phân hóa, phát triển, chín phôi;
nảy mầm, tái sinh cây chuyển gen

87
Hình 3.12.
Cây chuyển gen thế hệ T
0
trồng trong nhà lưới và một số
dị dạng của cây chuyển gen

89
Hình 3.13.
Quá trình nở hoa bông
91
Hình 3.14.

Hình 3.20.
Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen CryIAc ……………
109
Hình 3.21.
Sâu sống trên ĐC và chết trên dòng chuyển gen thế hệ T
2

117
Hình 3.22.
Sâu sống trên ĐC và dòng chuyển gen thế hệ T
2
sau 10
ngày nuôi ………………………………………
118 1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trên thế giới, bông (Gossypium sp.) là cây trồng kinh tế lấy sợi tự
nhiên quan trọng nhất. Hiện nay, cây bông được trồng ở gần 100 quốc gia, với
diện tích niên vụ 2010/2011 khoảng 33,3 triệu ha, sản lượng đạt 25,1 triệu tấn
bông xơ, giá trị trên 50 tỷ USD (ICAC, 2012 [67]). Tuy nhiên, cây bông bị
nhiều loài sâu gây hại. Trước khi có bông Bt, hàng năm, mức tổn thất do sâu
hại gây ra chiếm 24,5% tổng sản lượng bông và tiêu tốn lượng thuốc trừ sâu
chiếm 25% tổng lượng thuốc sử dụng trong nông nghiệp, trong khi, diện tích
trồng bông chỉ chiếm 2,4% tổng diện tích đất trồng trọt toàn cầu (Krattiger,
1997) [79]. Để khắc phục tổn thất do sâu hại gây ra, tăng hiệu quả kinh tế cây
bông và bảo vệ môi trường sinh thái, các nước trồng bông lớn đã sử dụng
phương pháp chuyển gen để tạo giống bông Bt kháng sâu.

bất kỳ giống bông nào. Mặc dù, cũng có nhược điểm như quy mô chuyển gen
lớn, tốn nhiều công lao động, phụ thuộc vào ngoại cảnh, nhưng phương pháp
chuyển gen này đang ngày càng được quan tâm sử dụng.
Xuất phát từ những cơ sở trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương
pháp chuyển gen để tạo dòng bông (Gossypium hirsutum L.) kháng sâu
xanh (Helicoverpa armigera Hübner)” được tiến hành.
2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học và phương
pháp cơ bản về tái sinh và chuyển gen cây bông; sàng lọc, đánh giá và chọn
lọc cây bông chuyển gen kháng sâu xanh; và góp phần phát triển lĩnh vực
khoa học chọn tạo giống cây trồng kháng sâu.

3
- Đưa kỹ thuật chuyển gen cây bông trở thành công cụ hỗ trợ đắc lực
cho công tác chọn tạo giống bông truyền thống và làm cơ sở áp dụng để chọn
tạo các loại giống cây trồng kháng sâu khác.
2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo ra dòng bông chuyển gen kháng sâu
xanh để làm vật liệu quý cho chương trình chọn tạo giống bông kháng sâu,
nhằm cung cấp cho sản xuất bông hàng hóa trong nước.
- Nhờ có giống bông chuyển gen kháng sâu xanh sử dụng trong sản
xuất, góp phần giảm thiểu rủi ro cho nông dân, giảm chi phí sản xuất, hạ giá
thành sản phẩm, tăng thu nhập cho người trồng bông, bảo vệ môi trường sống
và tính bền vững của hệ thống sản xuất nông nghiệp.
- Nhờ có giống bông chuyển gen kháng sâu xanh sử dụng trong sản
xuất, tạo bước tăng trưởng đột phá về diện tích và sản lượng, từng bước đáp
ứng nhu cầu bông xơ ngày càng tăng của ngành dệt may Việt Nam.
3. Mục đích và yêu cầu của đề tài
3.1. Mục đích của đề tài

thông qua tạo phôi soma và tạo đa chồi.
- Chuyển thành công gen CryIAc vào một số giống bông bằng phương
pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua
đường ống phấn.
- Tạo được 87 dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh. Đặc biệt, tạo
được 50 dòng kháng sâu xanh cao làm vật liệu quý cho chương trình chọn tạo
giống bông kháng sâu trong nước.

5
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Sơ lược về cây bông, tình hình sản xuất bông thế giới và Việt Nam
1.1.1. Sơ lược về cây bông
Cây bông (Gossypium sp.) thuộc chi Bông (Gossipyum), họ Cẩm Quỳ
(Malvaceae). Chi Bông có 45-50 loài, trong đó, 40-45 loài nhị bội (2n = 2x =
26) và 5 loài tứ bội (2n = 4x = 52). Có 4 loài bông trồng trọt: 2 loài nhị bội là
loài bông Cỏ châu Á (G. arboreum L.) và bông Cỏ châu Phi (G. herbaceum
L.), có trung tâm khởi nguyên ở Ấn Độ, Tây Nam Châu Á (Cỏ châu Á) và
Đông Phi (Cỏ châu Phi); và 2 loài tứ bội là loài bông Luồi (G. hirsutum L.) và
bông Hải Đảo (G. barbadense L.), có trung tâm khởi nguyên ở trung Mỹ
(Luồi) và trung tâm Nam Mỹ (Hải Đảo) (Brubaker et al., 1999 [28]; Endrizzi
et al., 1984 [43]; Fryxell, 1992 [50]).
Loài bông Cỏ châu Á được trồng chủ yếu ở Ấn Độ và Pakistan, loài
bông Cỏ châu Phi chỉ được trồng ở vùng khô hạn của châu Phi và châu Á.
Hiện nay, loài bông Luồi và Hải Đảo chiếm ưu thế về diện tích và sản lượng
trên thế giới. Loài bông Hải Đảo có chất lượng xơ tốt, được trồng ở Liên Xô
(cũ), Xu Đăng, Pêru, Ấn Độ và một số quốc gia khác, cung cấp 8% sản lượng
bông xơ. Loài bông Luồi có chất lượng xơ kém hơn bông Hải Đảo, nhưng cho
năng suất cao hơn và được trồng rộng rãi khắp nơi trên thế giới, đóng góp
90% sản lượng bông xơ (Zhang et al., 2007) [145].

Ở Việt Nam, nghề trồng bông có từ lâu đời. Theo nhiều tài liệu nghiên
cứu, nghề trồng bông ở Việt Nam bắt nguồn từ Ấn Độ, các giống bông được
trồng đầu tiên thuộc loài bông Cỏ châu Á, loài bông Luồi mới du nhập vào

7
Việt Nam khoảng cuối thế kỷ 19, đầu thế kỷ 20 (Hoàng Đức Phương, 1983 [9];
Vũ Công Hậu, 1962 [6]; 1971 [7]).
Đến năm 1975, nghề trồng bông ở Việt Nam được củng cố trở lại và
ngày càng phát triển, nhằm tự túc một phần nguyên liệu dệt may. Từ đó,
nghiên cứu chọn tạo giống bông mới để cung cấp cho sản xuất được nhà nước
hết sức quan tâm. Qua 20 năm nghiên cứu (1976-1996), đã thuần hóa, chọn
tạo và đưa vào sản xuất nhiều giống bông Luồi như TH1, TH2, M456-10,
MCU5, MCU9, LRA5166, TM1, D16-2, C118… Nhờ đó, các vùng trồng
bông ngày càng mở rộng tại miền Đông Nam bộ, duyên hải miền Trung và
Tây Nguyên. Mặc dù, các giống này cho năng suất khá cao (khoảng 0,8 tấn
hạt/ha) nhưng vẫn chưa ổn định trước những biến đổi bất lợi của các tiểu
vùng sinh thái trồng bông rất đa dạng. Bên cạnh đó, các giống này không có
khả năng kháng một số loại sâu hại chính như sâu xanh, rầy xanh, đồng thời
chất lượng xơ vẫn chưa đáp ứng được yêu cầu của công nghiệp dệt may, nên
sản xuất bông của nước ta trong giai đoạn này gặp nhiều khó khăn, diện tích
trồng bông hàng năm trong cả nước chỉ dao động khoảng dưới 10 nghìn ha
(Nguyễn Hữu Bình và Đào Hữu Vinh, 1998) [2].
Từ năm 1990 trở đi, Việt Nam nhập nội và thử nghiệm một số giống
bông lai từ Ấn Độ, đồng thời đẩy mạnh nghiên cứu sử dụng ưu thế lai, tập
trung vào giống lai cùng loài bông Luồi. Kết quả sử dụng giống lai nhập nội
Bioseed7 và giống lai nội địa đầu tiên L18, VN20 và VN35 thành công trong
sản xuất, đã góp phần mở rộng diện tích đáng kể và tăng năng suất 1,5-2 lần
(từ 0,6-0,7 tấn/ha lên 1-1,2 tấn/ha). Cho dù, các giống bông lai L18, VN20 và
VN35 có ưu thế lai cao về năng suất, chất lượng, có khả năng kháng rầy xanh
trung bình đến khá, nhưng chúng không có khả năng kháng sâu xanh, nên

tốt, phù hợp với điều kiện sinh thái Việt Nam là rất cần thiết.