ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
*** VÕ TRÍ NAM DỰ ĐOÁN EPITOPE TẾ BÀO B KHÔNG LIÊN TỤC TRÊN
PROTEIN HEMAGGLUTININ CỦA VIRUS CÚM A H5N1
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số chuyên ngành: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. TRẦN LINH THƯỚC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2012
Luận văn thạc sĩ
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG iii
DANH MỤC CÁC HÌNH iv
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Virus cúm A, phân type H5N1 4
1.1.1. Phân loại 4
1.1.2. Cấu trúc 4
1.1.3. Vòng đời 7
1.1.4. Diễn tiến của virus cúm A H5N1 9
1.2. Đáp ứng miễn dịch tế bào B 10
1.2.1. Giới thiệu tế bào B 10
1.2.1.1. Quá trình biệt hóa 10
1.2.1.2. Quá trình hoạt hóa 10
1.2.2. Kháng thể 12
1.2.2.1. Định nghĩa 10
1.2.2.2. Cấu trúc kháng thể 10
1.2.3. Giới thiệu epitope 17
1.2.3.1. Khái niệm 17
1.2.3.2. Phân loại 17
1.3 Tình hình nghiên cứu dự đoán epitope 19
1.3.1. Các cơ sở dữ liệu 19
Luận văn thạc sĩ
2.2.6. Khảo sát gắn cấu trúc kháng thể với các cấu trúc peptide dự đoán, epitope
và non-epitope 40
Luận văn thạc sĩ
2.2.7. Phân tích kết quả khảo sát và đề xuất các epitope tế bào B không
liên tục 40
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 18
3.1. Khảo sát bộ thông số tối ưu cho chương trình Autodock 43
3.1.1. Thu nhận cấu trúc kháng thể gắn peptide HA 47
3.1.2. Phân tích kết quả khảo sát gắn 47
3.2. Thu nhận cấu trúc kháng thể 47
3.3. Dự đoán epitope không liên tục tế bào B bằng chương trình Discotope, từ đó
thiết kế các peptide cần dự đoán 49
3.4. Thu nhận cấu trúc các epitope và non-epitope 51
3.5. Khảo sát gắn cấu trúc kháng thể với các cấu trúc peptide dự đoán, epitope và
non-epitope 52
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42
4.1. Kết luận 57
4.2. Đề nghị 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Trang ii PDB Protein Data Bank
RMSD Root−mean−square−deviation
RNP RNA−nucleoprotein
vRNP Virus RNA−nucleoprotein
Luận văn thạc sĩ
Trang iii DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Chức năng của các protein virus cúm A 6
Bảng 1.2: Thống kê tình hình sử dụng các chương trình khảo sát gắn (2006) 28
Bảng 3.1: Cấu trúc kháng thể gắn HA thu nhận từ cơ sở dữ liệu PDB 43
Bảng 3.2: Độ sai lệch cấu trúc giữa peptide HA sau khi khảo sát gắn và peptide
thực nghiệm 44
Bảng 3.3: Năng lượng các trạng thái gắn kết của các peptide lên phân tử kháng
thể 46
Bảng 3.4: Bộ thông số tối ưu thu được 46
Bảng 3.5: Kết quả dự đoán bằng Discotope đối với các amino acid trên phân tử
protein HA có tham gia vào tương tác với phân tử kháng thể 46
Bảng 3.6: Các peptide được thiết kế 51
Hình 1.11: Các dạng gắn của kháng nguyên lên kháng thể 17
Hình 1.12: Epitope liên tục và epitope không liên tục 18
Hình 1.13: Thống kê tình hình sử dụng các chương trình khảo sát gắn (2006) 26
Hình 1.14: Mẫu tập tin kết quả của chương trình Discotope 29
Hình 2.1: Quy trình dự đoán epitope không liên tục tế bào B trên protein
Hemagglutinin của virus cúm A phân type H5N1 31
Hình 2.2: Quy trình khảo sát sự gắn kết peptide HA lên kháng thể bằng chương
trình Autodock 33
Hình 2.3: Giao diện chương trình AutodockTool (ADT) 34
Hình 2.4: Chọn phân tử nước trong đại phân tử 35
Hình 2.5: Quá trình thêm Hydro 36
Luận văn thạc sĩ
Trang v Hình 2.6: Chọn các liên kết xoay cho phân tử ligand 36
Hình 2.7: Giao diện xác định thông số cho Autogrid 38
Hình 2.8: Tập tin thông số cho Autogrid 38
Hình 2.9: Tập tin thông số cho Autodock 39
Hình 3.1: Kết quả khảo sát gắn giữa peptide HA và kháng thể 45
Hình 3.2: Các gốc amino acid trên phân tử HA tham gia tương tác với phân tử
kháng thể 45
Hình 3.3: Cấu trúc phân tử protein HA mã số 1JSM 49
Hình 3.4: Kết quả dự đoán epitope tế bào B không liên tục bằng chương trình
trên, vai trò của các công cụ tin sinh học góp một phần không nhỏ. Nhiều phương
pháp đã được áp dụng vào dự đoán epitop bên cạnh các phương pháp mới ra đời đã
phục vụ rất nhiều cho các nghiên cứu nói trên. Có thể kể đến các phương pháp như
phương pháp HMM (Hidden Markov Model), ANN (Artificial Neuron Network)
hay SVM (Support Vector Machine) đã được áp dụng vào dự đoán epitope trên
trình tự; các phương pháp như
phương pháp mô hình hóa tương đồng, phương pháp
dùng thang tính chất hóa lý của các amino acid hay phương pháp Discotope đã được
áp dụng cho việc dự đoán epitope cấu trúc. Áp dụng các phương pháp kể trên, rất
nhiều server, rất nhiều chương trình đã ra đời để phục vụ công việc nghiên cứu như
Discotope, MHCPred, CTLPred, Bebipred, CEP… Có thể nói các phương pháp
trong tin sinh học đang được áp dụng trên diện rộng và cả chiều sâu giúp tạo một
Luận văn thạc sĩ Mở đầu
Trang 2
nguồn lực lớn hỗ trợ cho các nghiên cứu thực nghiệm.
Tuy nhiên, trong khi các phương pháp dự đoán epitope liên tục dựa trên trình
tự đang phát triển mạnh mẽ và thu được những kết quả rất khả quan thì việc dự
đoán epitope không liên tục đang gặp phải những hạn chế nhất định, đặc biệt là hạn
chế về khả năng ứng dụng. Các epitope nhận diện bở
i tế bào B đang được rất kỳ
vọng do khả năng đáp ứng miễn dịch hiệu quả hơn hẳn so với epitope nhận diện bởi
tế bào T. Các khảo sát cho thấy hơn 90% các epitope nhận diện bởi tế bào B là
epitope không liên tục nên việc áp dụng các phương pháp vào dự đoán đang gặp rất
nhiều hạn chế. Lý do chính vì các epitope này có chiều dài dao động trong một
khoảng khá rộng (từ 6 đến 28 amino acid) và tính chấ
t không liên tục làm cho việc
tế bào B bằng chương trình Discotope, từ đó thiết kế các đoạn peptide
liên tục dùng cho dự đoán bằng phương pháp khảo sát gắn
- Khảo sát gắn giữa các đoạn peptide thiết kế được với phân tử kháng thể
nhằm tìm ra epitope kỳ vọng làm dữ liệ
u cho các nghiên cứu chế tạo
vaccine thực nghiệm.
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Chương 1:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 4
1.1. Virus cúm A, phân type H5N1
1.1.1. Phân loại [8]
Trang 5
trong màng. HA đóng vai trò tương tác với phân tử acid sialic (acid N-acetyl-
neuraminic) và giúp cho phân tử virus xâm nhập và bên trong tế bào chủ thông qua
quá trình dung hợp màng. Ngoài ra, HA còn một vùng có chức năng dung hợp
màng khi phân tử virus đã xâm nhập vào tế bào chủ. Vì protein HA mang 5 vùng
kháng nguyên chính của virus nên kháng thể hiện nay được sản xuất chủ yếu theo
hướng trung hòa HA. Tuy nhiên, bản thân HA có tần số biến đổi rất cao nên việc sử
dụng kháng nguyên loại này rất dễ bị thụ động. HA có hai cơ chế biến đổi là s
ự
chuyển dịch kháng nguyên (antigentic drift) và sự chuyển đổi kháng nguyên
(antigentic shift). Trong cơ chế chuyển dịch kháng nguyên, các đột biến điểm ngẫu
nhiên trên RNA được tích lũy dần qua thời gian có thể tạo ra chủng virus mới, làm
mất tác dụng của kháng thể. Cơ chế chuyển đổi kháng nguyên xảy ra khi hai chủng
virus khác nhau cùng xâm nhập vào một tế bào chủ. Lúc này, giữa chúng có sự trao
đổi các phân đoạn RNA với nhau. Cơ chế này gây ra những biến đổi l
ớn và nhanh
chóng trong bộ gen virus [11].
Hình 1.1: Cấu trúc của virus cúm A
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 6
Bảng 1.1: Chức năng của các protein virus cúm A [11]
Mảnh Protein Tên đầy đủ Chức năng
1 PB1 Polymerase B1 protein
Tham gia vào giai đoạn kéo dài
nguyên ở phía đầu. Ngoài ra, NA cũng có cơ chế đột biến hoán chuyển kháng
nguyên giống như HA. Trên NA có một vài gốc amino acid quan trọng mà khi đột
biến sẽ có thể kháng lại hoạt động của các phân tử ức chế NA. Sự biến
đổi các
amino acid này như sau: Arginine ở vị trí 292 thành Lysine, Histidine ở vị trí 274
thành Tyrosine, arginine ở vị trí 152 thành Lysine, acid Glutamic ở vị trí 119 thành
Valine.
1.1.3. Vòng đời
Virus cúm A nhận diện và bám dính trên một loại tế bào nhất định. Những tế
bào này có thụ thể là acid 5-N-acetyl neuraminic (acid sialic), hoặc trong một số
trường hợp thụ thể có thể là N-glycol neuraminic. Sau khi nhận diện, protein HA
trên bề mặt virus sẽ gắn lên các thụ thể và bắt đầu quá trình xâm nhiễm. Do sự kết
dính của HA và acid sialic ở xung quanh đ
iểm khởi đầu nên sau khi gắn được lên
các thụ thể trên bề mặt tế bào, màng tế bào chủ nhanh chóng phủ lấy phần tử virus
và dần dần được nhấn chìm vào trong tế bào chủ. Một bóng màng có chứa virus
tách dần ra khỏi màng tế bào và di chuyển và trong tế bào chất. H
+
được bơm vào
bên trong nhờ một loại protein vận chuyển ion H
+
trên màng đến pH tương thích
(pH=5-5,5), khi đó HA được cắt đứt thành nhiều domain và để lộ ra phần kỵ nước.
Phần kỵ nước tạo ra sẽ dính vào màng lipid của bóng màng dẫn đến sự hòa nhập
của màng bao virus và bóng màng. Sự kết hợp này tạo ra khoảng không gian làm
giải phóng vật chất bên trong virus vào trong tế bào chất của tế bào chủ. Mặt khác,
ion H
+
cũng được vận chuyển vào trong virus nhờ protein matrix (M2) trên màng
virus. Sự acid hóa này phá vỡ phức hợp M1-vRNP (virus RNA-Nucleoprotein), giải
qua bộ máy Golgi.
Quá trình giải phóng virus phụ thuộc vào protein NA. Protein này phân hủy
các thụ thể acid sialic của tế bào chủ còn bám trên màng bao virus, không cho các
phần tử virus, sau khi được phóng thích ra, gắn chùm lại với nhau, cũng như ngăn tế
bào virus gắn vào tế bào chủ do tương tác vớ
i các NA gắn trên màng.
1.1.4. Diễn tiến của virus cúm A H5N1
Hình 1.3: Sự lan nhanh của virus cúm A (H5N1) trên toàn thế giới
Những triệu chứng do virus cúm được Hippocrates phát hiện và mô tả lần
đầu tiên vào năm 412 trước công nguyên. Nhưng các triệu chứng này rất khó kiểm
chứng do dễ nhầm lẫn với triệu chứng của bệnh bạch hầu, dịch hạch, sốt xuất huyết
và thương hàn. Năm 1357, tên gọi “influenza” ra đời lần đầu tiên tại Ý. Từ đó đến
nay đã có nhiều tr
ận dịch xảy ra. Trong đó, có ba trận dịch lớn xảy ra trong thế kỷ
qua đó là vào năm 1918, 1957 và 1968. Nghiêm trọng nhất là trận dịch vào năm
1918 có 80% dân số bị nhiễm bệnh, gây tử vong 20-50 triệu người. Bộc phát cuối
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 10
cùng trong thế kỷ qua xảy ra 1997 ở Hồng Kông khi một virus cúm mới (H5N1) có
glycoprotein HA của virus cúm gây bệnh trên loài chim đã lây lan sang người và
gây tử vong 6 trong 8 bệnh nhân bị nhiễm bệnh. Một chủng H5N1 khác được phân
lập năm 2003-2004 ở một vài nước châu Á bao gồm Thái Lan và Việt Nam gây tử
vong 31 trong 43 bệnh nhân. Theo số liệu ngày 12 tháng 6 năm 2009 của WHO,
cho đến nay dịch cúm của virus cúm A phân type H5N1 đã lan nhiều nước trên thế
giới và gây tử vong 145 người (hình 1.3). Việt Nam vẫn nằm trong tình trạ
ng báo
quá trình biệt hóa, chúng biểu lộ một số dấu ấn bề mặt (surface marker), dấu ấn có
tính chất kinh điển là SIg mà đa số là IgM đơn phân có đầu kỵ nước của chuỗi nặng
giúp cho việc neo phân tử vào màng t
ế bào. Đây là thụ thể chủ yếu mà tế bào
lympho B dùng để nhận biết kháng nguyên. Ngoài ra các tế bào lympho B còn có
các dấu ấn khác như dấu ấn cho phân tử MHCII, các thụ thể dành cho bổ thể (CR2,
CD21)…
1.2.1.2. Quá trình hoạt hóa
Khi một kháng nguyên đi vào cơ thể chúng sẽ gặp các tế bào lympho B có
mang các kháng thể bề mặt khác nhau. Mỗi một kháng thể có vị trí nhận biết kháng
nguyên và kháng nguyên thì chỉ kết hợp với kháng thể nào phù hợp với nó nhất.
Các tế
bào lympho B khi đã kết hợp được với kháng nguyên sẽ nhận được
một tín hiệu khởi động để tiếp tục biệt hóa thành tương bào, là các tế bào có tiềm
năng sinh kháng thể. Do các tế bào lympho B đã được chương trình hóa để chỉ sản
xuất một loại kháng thể đặc hiệu nào đó, cho nên các kháng thể vừa mới được tổng
hợp bởi tương bào sẽ hoàn toàn tương đồng với kháng thể g
ốc ban đầu. Do đó
kháng nguyên chọn kháng thể nhận biết mình một cách có hiệu quả.
Bên cạnh đó, sự hoạt hóa tế bào lympho B còn phụ thuộc vào bản chất của
kháng nguyên (hình 1.5), cụ thể như sau:
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 12
− Kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức type I ở nồng độ đủ cao có thể hoạt hóa
trực tiếp một tỷ lệ đáng kể lympho B.
− Kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức type II có cấu trúc lập lại không bị
giáng hóa có thể tạo ra liên kết chéo (cross linking) để hoạt hóa tế bào lympho B.
7
-10
9
loại quyết định kháng nguyên khác nhau
trong thiên nhiên, như vậy cũng có khoảng 10
7
-10
9
loại tế bào lympho B tương ứng.
Sự tạo thành tương bào
Sau khi tiếp xúc lần đầu với kháng nguyên, tế bào lympho B tăng sinh nhiều
đợt rồi chuyển thành tương bào sản xuất kháng thể (hình 1.7, 1.8). Khoảng vài ngày
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 14
sau khi tiếp xúc với kháng nguyên, kháng thể xuất hiện trong máu và đạt nồng độ
cao nhất vào khoảng tuần lễ thứ hai. Đó là đáp ứng tiên phát.
Do vậy trên lâm sàng các xét nghiệm tìm kháng thể đặc hiệu thường được
thực hiện vào khoảng sau một tuần khởi phát bệnh, lúc mà số lượng kháng thể đủ
cao để có thể cho kết quả dương tính.
Hình 1.7: Mỗi một loại kháng nguyên chọn lọc một tế bào lympho B tạo kháng
thể
Hình 1.8: Tế bào lympho B tăng sinh và biệt hóa thành nhiều tương bào
Copyright: Tài liệu đại học ©