Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế
Trờng đại học y h nội Lê văn hng Chuyên đề 2
Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu
Chuyên đề sâu có liên quan đến nội dung luận án tiến sỹ chuyên ngành y
học: "Xác định vi khuẩn lậu v phát hiện đột biến gen
kháng Ciprofloxacin bằng kỹ thuật sinh học phân tử
tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007" Chuyên ngành Vi sinh vật
Mã số: 62.72.68.01 Hà Nội - 2008
Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế
Trờng đại học y h nội

Đặt vấn đề
1
1. Một số nghiên cứu sinh học về vi khuẩn lậu
2
1.1. Hình thể của vi khuẩn lậu
2
1.2. Tính chất nuôi cấy
3
1.3. Tính chất sinh vật hóa học
4
1.4. Định týp vi khuẩn
7
1.4.1 Týp dinh dỡng
7
1.4.2 Týp huyết thanh
8
1.4.3. Xác định kiểu gen
8
1.5. Một số đặc điểm về siêu cấu trúc Protein porin
(por)
9
1.6. Hệ thống di truyền
10
1.7. Các cấu trúc bề mặt khác
12
2. Bệnh lậu v tình hình kháng kháng sinh của
vi khuẩn lậu
12
2.1. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lậu
12

18
3. Sự đề Kháng kháng sinh của Neisseria
gonorrhoeae
19
3.1. Vấn đề và xu hớng kháng thuốc hiện nay
20
3.1.1 Việc thu thập, thẩm định và sự thích hợp của dữ liệu về độ
nhạy cảm
20
3.1.2 Nguồn số liệu
21
3.1.3 Sử dụng số liệu về độ nhạy cảm với kháng sinh trong phác
đồ điều trị dựa vào dịch tễ học
22
3.2. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu
27
3.2.1. Cơ chế chung
27
3.2.2. Cơ chế kháng những thuốc đợc dùng trong điều trị bệnh
lậu
29
3.3. Các yếu tố góp phần lan rộng kháng thuốc
34
3.3.1. Sử dụng và lạm dụng kháng sinh
34
3.2.2. Dịch tễ học sự lan truyền lậu cầu kháng thuốc
36
4. Khuyến cáo về sử dụng kháng sinh trong điều
trị vi khuẩn lậu
38

KDO Ketodeoxy deoxy octanoic acid
LCR Ligase chain reaction: phản ứng chuỗi ligase
LF Lactoferrin
LOS lipo-oligosaccharide
LPS Lipopolysacharide
LTQĐTD Lây truyền qua đờng tình dục
Met Methionin
MIC Minimum inhibitory concentration: nồng độ ức chế tối thiểu
mM Mili mole
NAG
Nonagglutination: Không ngng kết
PBPs Penicillin-binding proteins: protein gắn Penicillin
PCR Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi polymerase
PFGE Pulsed field gel electrophoresis: điện di trờng xung
Por Protein porin
PPNG
Penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae: vi khuẩn lậu
sản sinh men Penicillinase.
QRNG
Quinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae: vi khuẩn lậu kháng
Quinolone
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism: kỹ thuật đa hình
chiều dài đoạn cắt giới hạn
Rmp Reduction modifiable protein: protein có thể biến đổi khử
RT-PCR
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis: điện
di trên gel polyacrylamid
STD
Sexually Transmitted Disease: bệnh lây truyền qua đờng tình

khuẩn lậu đề kháng ciprofloxacin là 82,1%; penicillin (31,1%); tetracyclin
(16,5%); erythromycin (3,8%) và azithromycin (1,9%)
Việc giám sát sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu là rất cần thiết vì
không những giúp cho các chơng trình giám sát tính kháng kháng sinh cấp
Quốc gia và Quốc tế theo dõi mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lậu, mà còn
giúp bác sĩ lâm sàng xây dựng mô hình điều trị bằng kháng sinh hợp lý nhằm
giảm chi phí, giảm thời gian điều trị cho bệnh nhân, giảm thiểu nguồn lây cho
cộng đồng.
Xuất phát từ lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài:
Nghiên cứu sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu.
Nhằm 2 mục tiêu:
1. Theo dõi mức độ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu phân lập
đợc tại Viện Da liễu Quốc gia từ 2005 - 2007.
2. Tìm hiểu cơ chế đề kháng những kháng sinh đợc dùng trong điều trị
bệnh lậu.

2
1. Một số nghiên cứu sinh học về vi khuẩn lậu
1.1. Hình thể của vi khuẩn lậu
Vi khuẩn lậu Neisseria gonorrhoeae thuộc họ Neisseriaceae. Trong giống
Neisseria, có loài gây bệnh, có loài hoại sinh; chúng khác biệt nhau về một số
tính chất sinh vật hoá học (lên men đờng glucose và không sinh hơi khi sử
dụng một số loại đờng). Dựa vào tính chất này, ngời ta phân biệt vi khuẩn
lậu với một số Neisseria hoại sinh khác [12].
Trên tiêu bản lấy mủ từ bệnh nhân bị bệnh lậu và nhuộm Gram, vi khuẩn
lậu là những cầu khuẩn hình hạt cà phê đứng thành đôi, hai mặt dẹt quay vào
nhau, bắt mầu Gram-âm. Vi khuẩn lậu có kích thớc 0,6

+ Thành phần chất tăng sinh (Isovitalex) bao gồm :
- Diphosphopyridin nucleotide (coenzyme)
- Carboxylase
- Para-aminobenzoic acid
- Thiamin-HCL
- Vitamin B12
- L-glutamine
- L-cystine-2HCL
- L-cystine-HCL.2H
2
O
- Adenine
- Guanin-HCL
4
- Fe(NO
3
)
3
.9 H
2
O
- Dextrose
+ Chất ức chế (V-C-N) :
- Vancomycin (ức chế vi khuẩn Gram-dơng)
- Colistin (ức chế trực khuẩn Gram-âm)
- Nystatin (ức chế nấm)
Nhiệt độ sinh trởng thích hợp là 35-36

Lấy 1 lam kính sạch nhỏ lên 1 giọt dung dịch hydrogenperoxide 30%,
dùng que cấy lấy 4-5 khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy hòa trực tiếp vào giọt thuốc
thử trên phiến kính.
Phản ứng dơng tính: trong vòng 2-3 giây tạo nhiều bọt và các bóng nớc.
Phản ứng âm tính: không tạo bọt hoặc tạo bọt chậm, ít, yếu sau 3 giây.
- Xác định khả năng phân hủy đờng nhanh theo thờng quy của WHO
(1999).
Sử dụng bộ kit Neisseria 4H
Môi trờng Neisseria 4H gồm 4 loại đờng :
+ Glucose
+ Mantose
+ Fructose
+ Saccharose
6
- Chuẩn bị : để hộp kit ở nhiệt độ phòng. Bộ kit gồm có:
+ Phiến thử (Well microplates).
+ Dung dịch trộn vi khuẩn (Suspensolution): 2ml.
+ Dung dịch Mc Farland của kit: 1ml.
+ Nắp nhựa đậy phiến thử.
+ Que cấy và micropipet nhỏ giọt cùng chủng vi khuẩn lậu cần thử.
- Các bớc tiến hành :
+ Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc vi
khuẩn lậu nuôi cấy sau 18-24 giờ.
+ Hoà đều vi khuẩn vào dung dịch suspensolution của kit.
+ So sánh với độ đục Mc Farland số 3 của kit.
+ Dùng micropipet nhỏ vào mỗi giếng 100l huyền dịch vi khuẩn, trộn đều.
+ Đậy nắp và ủ ở tủ ấm 37

-
. Vi khuẩn lậu phân lập từ ngời bệnh biểu hiện tính
đa dạng rõ rệt về khả năng sinh tổng hợp, có thể phản ánh môi trờng giầu
dinh dỡng của vật chủ, cung cấp cho vi khuẩn phần lớn các hợp chất cần thiết
cho sự phát triển của chúng. Các nghiên cứu di truyền cho thấy các chủng có
kiểu hình dinh dỡng nh nhau (thí dụ Arg
-
) có thể có nhiều đột biến theo một
chu trình hóa sinh nhất định [47]. Hệ thống định týp dinh dỡng đợc sử dụng
thành công trong các nghiên cứu dịch tễ khác nhau. Một số týp dinh dỡng rất
quan trọng về sinh học và dịch tễ học, thí dụ, Arg
-
Hyx
-
(hypoxanthin
-
) Ura
-

(uracil
-
). Týp dinh dỡng thờng liên quan tới nhiều đặc tính khác nhau nh
xu hớng gây nhiễm trùng niệu đạo nam không triệu chứng, tăng khả năng
gây nhiễm khuẩn huyết và các đặc tính khác [19]. Do sự phức tạp của một hệ
thống môi trờng với từng hóa chất riêng biệt và thời gian bảo quản ngắn, kỹ
thuật định týp dinh dỡng thờng không đợc áp dụng rộng rãi trong các
phòng xét nghiệm lâm sàng.

9
Phối hợp với những hệ thông định týp khác, xác định kiểu gen đã góp phần
giải quyết hiệu quả việc định týp vi khuẩn.
1.5. Một số đặc điểm về siêu cấu trúc Protein porin (por)
Khi các protein màng ngoài của vi khuẩn lậu đợc hòa tan và kiểm tra bằng
kỹ thuật điện di trên SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis), nhiều protein đã đợc thấy. Thông thờng, protein dễ thấy
nhất trên SDS-PAGE này là protein 34kDa-36kDa trớc kia đợc gọi là P.I
nhng nay đợc gọi là Por. Por bộc lộ trên bề mặt màng ngoài và ở trạng thái
tự nhiên trong màng, nó tồn tại nh một chất tam phân [14]. ở trong màng
ngoài, nó là lipo-oligosaccharid (LOS) và cả protein có thể biến đổi khử
(Rmp-Reduction modifiable protein) [26].
- Lipo-olygosacharid (LOS)
Tất cả vi khuẩn lậu đều có LOS trên bề mặt tế bào, tơng tự
lipopolysacharid (LPS) của các vi khuẩn Gram-âm khác. LOS của vi khuẩn
lậu chứa một nửa là lipid A và một nửa là polysacharid lõi gồm KDO
(ketodeoxy deoxy octanoic acid), heptose, glucose, galactose và glucosamin
hoặc galactosamin. Nh vậy LOS của vi khuẩn lậu rõ ràng nhỏ hơn LPS điểm
hình của các vi khuẩn Gram-âm khác. Những đờng cốt lõi của LOS tạo nên
kháng nguyên của vi khuẩn, do vậy nó có vai trò quan trọng đối với phản ứng
miễn dịch diệt khuẩn; những kiểu hình khác nhau của kháng nguyên lại có thể
là quan trọng trong sinh bệnh học. Quả thực, nhiều chứng cứ cho rằng vi
khuẩn lậu với LOS "ngắn" thì nhạy cảm huyết thanh nhng lại có thể xâm
nhập tế bào chủ; còn những vi khuẩn lậu với những LOS "dài" thì đề kháng
huyết thanh và không xâm nhập đợc.
- Protein có thể biến đổi khử (Rmp)
Vi khuẩn và tất cả Neissseria gây bệnh đều có một protein Rmp mang tính

-lactamase (penicilinase) trên transposon Tn3 [46]. Các hệ
thống đột biến gen "con thoi" tạo ra những đột biến ở một đoạn trên ADN của
vi khuẩn lậu đợc nhân bản ở E. coli và dùng hệ thống này chuyển ADN đã
11
- Plasmid
Vi khuẩn lậu chứa một plasmid tự truyền (tiếp hợp đợc), có trọng lợng
phân tử 36kb. Các dẫn xuất lớn hơn một chút của plasmid 36kb đã đợc phân
lập, có chứa transposon tetM kháng tetracyclin [40]. Nhiều plasmid
-lactamase
(kháng penicilin) khác nhau của vi khuẩn lậu đã đợc phân lập và xác định
đặc điểm. 2 plasmid hay gặp nhất là khoảng 5,3 hoặc 7,2kb [41]. Phần lớn lậu
cầu cũng chứa một plasmid 4,2kb nhng cha rõ chức năng (cryptic plasmid).
Chuỗi ADN của plasmid này đã đợc xác định. Đôi khi có thể phân lập đợc
vi khuẩn lậu không chứa plasmid 4,2kb sao chép tự do này nhng chúng vẫn
có vẻ bình thờng về các đặc tính sinh học.
- Cơ chế biến đổi Opa
Tất cả các gen Opa từ các chủng vi khuẩn lậu đều đợc xếp nhóm và xếp
chuỗi [17], [49]. Khi lai giống phơng Nam đợc thực hiện với gen Opa đã
phân nhóm, có thể nhìn thấy tới 12 mảnh giới hạn liên quan tới Opa của ADN
nhiễm sắc thể, cho thấy có một họ các gen Opa trong nhiễm sắc thể [17], [49].
Mỗi gen Opa là một gen hoàn hảo với các hoạt chất của nó và mỗi gen đợc
sao chép sang ARN bất cứ lúc nào [50]. Thay đổi biểu hiện của các gen này
đạt đợc nhờ thay đổi đơn vị lặp lại pentameric giống nhau (CTCTT) đợc
định vị xuôi dòng ngay từ ATG bắt đầu codon, trong khoảng thời gian ADN
mã hóa chuỗi tín hiệu kỵ nớc, và ngợc dòng các chuỗi mã hóa cho protein
cấu trúc hoàn thiện [17]. Khi nhiều đơn vị lặp lại này chia đều cách 3 (thí dụ:
9, 12, 15 ) gen tịnh tiến trong cấu trúc và biểu thị một protein Opa. Nhiều

13
ở phụ nữ triệu chứng phức tạp hơn: tiết dịch niệu đạo, âm đạo. Vị trí bị
bệnh của phụ nữ thờng ở niệu đạo, cổ tử cung, tuyến Skène, tuyến Bartholin,
có khi tới cả tử cung, vòi trứng, buồng trứng [36].
Viêm trực tràng: thờng gặp ở những ngời đồng tính luyến ái nam. Triệu
trứng viêm trực tràng do vi khuẩn lậu thờng không điển hình.
Nhiễm vi khuẩn lậu ở họng thờng gặp ở bệnh nhân đồng tính luyến ái
nam và quan hệ đờng miệng [13].
2.1.2. Bệnh lậu ở trẻ em
Thờng biểu hiện bệnh ở mắt do lây vi khuẩn lậu từ mẹ trong thời kỳ sinh
con, phổ biến nhất là chảy mủ kết mạc sau đẻ 1-7 ngày. Nếu không đợc điều
trị kịp thời, có thể dẫn tới mù loà. Có thể gặp viêm âm hộ, âm đạo, niệu đạo do
vi khuẩn lậu ở các bé gái do dùng chung chậu với bố mẹ bị bệnh lậu.
2.1.3. Nhiễm trùng lậu lan toả
Bệnh thờng gặp ở những ngời bị bệnh lậu nhng không đợc điều trị kịp
thời, đúng phác đồ. Hầu hết nhiễm vi khuẩn lậu lan toả xảy ra ở phụ nữ. Biểu
hiện của bệnh nh: viêm khớp, viêm gan, viêm cơ tim, viêm nội tâm mạc,
viêm màng não
, nhiễm vi khuẩn lậu trên da [2].
2.2. Bệnh lậu
2.2.1. Tình hình trên thế giới
- Theo thống kê của WHO, hàng năm trên thế giới có hơn 60 triệu ngời bị
bệnh lậu. Riêng ở Mỹ hàng năm, có khoảng 2 triệu ngời mới mắc, tỷ lệ phụ
nữ có thai nhiễm vi khuẩn lậu là 6%. ở London (Anh), theo dõi 516 thai phụ
trong 2 năm, ngời ta thấy thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 0,4% [56].
- Tỷ lệ lây lan ở các nớc cũng khác nhau: Bỉ là 0,3%, Uganda 3,4%, châu
Mỹ La tinh 1,2% [55].
15
2.4 Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu
2.4.1. Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu trên thế giới

Việc sử dụng penicillin trong điều trị bệnh lậu lần đầu tiên đợc khuyến
cáo vào thập niên 40. Bệnh nhân bị bệnh lậu đợc điều trị bằng penicillin cho
kết quả tốt. Năm 1950, bắt đầu xuất hiện những chủng vi khuẩn lậu kháng lại
penicillin. Mức độ kháng lại penicillin ngày càng gia tăng với tốc độ khác
nhau tùy từng vùng và từng khu vực trên thế giới. Cho đến năm 1976, lần đầu
tiên phát hiện các chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin có -lactamase, các
chủng này phân lập đợc ở Anh, Mỹ, Tây Phi, châu
á (Philippines) và vùng
Cận Đông [51].
Sự kháng penicillin do hình thành -lactamase của một số chủng vi khuẩn
lậu là trở ngại lớn trong điều trị, vì chúng không bị tiêu diệt bởi penicillin liều
cao và bắt buộc phải thay thế bằng một kháng sinh khác. ở châu á, châu Phi
tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin có -lactamase từ 30-50%.
Theo WHO (1992) tại các nớc trong khu vực Tây-Thái Bình Dơng ngời
ta đã phân lập đợc các chủng vi khuẩn lậu có -lactamase là: Hồng Kông
40%, Hàn Quốc (80%), Thái Lan (28,2%), Nhật Bản (2,9%).
Theo WHO (1993) tỷ lệ kháng spectinomycin của vi khuẩn lậu là 5,5% ở
New Caledonia; 5,3% ở Trung Quốc năm 2000.
Theo WHO (2001), tỷ lệ kháng nhóm quinolon của vi khuẩn lậu: Trung
Quốc là 54,2% (1997,1998) tăng lên 85,2% (2000); ở Nhật Bản tỷ lệ này là
40%, Hàn Quốc (16%), Brunei (12%), Singapore (19%), Philippines (37,9%) [59].
Ceftriaxon là kháng sinh mới thuộc thế hệ thứ 3 của nhóm cephalosporin,
có tác dụng điều trị bệnh lậu rất tốt vì có hoạt tính cao đối với vi khuẩn lậu và
đối với cả các chủng đã kháng penicillin, tetracycline với mức độ cao. Tỷ lệ

- Theo Đào Việt Hải và cộng sự nghiên cứu tại Đắc Lắc (1991): tỷ lệ vi
khuẩn lậu kháng lại penicillin là 88%; cephalothin (18,25%); tetracyclin
(88,35%); cloramphenicol (39,47%) và erythromycine (38,64%) [3].
17
- Theo Nguyễn Văn Thục tại thành phố Hồ Chí Minh (1994): tỷ lệ vi khuẩn
lậu kháng lại penicillin là 94,67%; tetracyclin (5,33%); gentamicin (15,38%);
ceftriaxone (0%); chloramphenicol 1,33%; nalidixic acid 1,33% [7].
- Theo Lê Thị Phơng (1996-2000) tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng penicillin là
65,46%; nalidixic acid (41,75%); tetracyclin (40,50%); ciprofloxacin
(35,60%); chloramphenicol (20,61%); cephalothin (5,15%); erythomycin
(2,06%). Tính riêng năm 2001 tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng nalidixic acid là
(56,68%); penicillin 47,47%; tetracyclin (44,52%); ciprofloxacin (42,67%);
chloramphenicol (23,23%); spectinomycine (0,64%) [6].
- Theo Lê Văn Hng, (từ 7.2002 đến 6.2003) tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại
ciprofloxacin là (60,87%); chloramphenicol (43,91%); penicillin 27,39%;
tetracyclin (23%); erythomycin (13,48%); cephalothin (4,78%);
Spectinomycin(3,93%) [4].
2.5. Độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn lậu phân
lập đợc tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007
2.5.1. Độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn lậu năm 2005
Mức độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm chính của vi khuẩn lậu năm 2005
Tên kháng sinh Nhạy cảm (%) Trung gian (%) Đề kháng (%)
Penicillin 38,27 26,54 35,19
Ceftriaxone 100 0 0
Ciprofloxacin 19,14 21,6 59,26
Spectinomycin 100 0 0
Tetracyclin 90,12 0 9,88

Erythromycin 138 65,10 66 31,13 8 3,77
Azithromycin 208 98,11 04 1,89 0 0
Cefotaxime 210 99,06 02 0,94 0 0

với kháng sinh của vi khuẩn lậu năm 2007
2.5.3. Độ nhạy cảm
Mức độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm chính của vi khuẩn lậu năm 2007
S I R
Tên kháng sinh
n % n % n %
Penicillin 75 57,14 6 4,65 48 37,21
Ceftriaxone 129 100 0 0 0 0
Ciprofloxacin 14 10,85 45 34,88 70 54,26
Spectinomycin 129 100 0 0 0 0
Tetracyclin TRNG: 48 (37,5%)
Mức độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ sung của vi khuẩn lậu năm 2007
S I R
Tên kháng sinh
n % n % n %
Cephalothin 66 54,10 46 37,70 10 8,20
Chloramphenicol 101 82,78 0 0 21 17,22
Erythromycin 75 62,50 40 33,33 05 4,16
Azithromycin 122 99,19 01 0,81 0 0
Cefotaxime 125 96,89 04 3,11 0 0
19
Qua theo dõi 3 năm 2005, 2006 và 2007, chúng tôi nhận thấy:
- Với các kháng sinh thuộc nhóm chính