HƯỚNG DẪN ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG
VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC INVIVO
CÁC CHẾ PHẨM THUỐC

Sinh khả dụng biểu thị tốc độ và mức độ hấp thu của dược chất từ chế phẩm thuốc
vào hệ tuần hoàn. Hai chế phẩm được coi là tương đương sinh học nếu sinh khả
dụng khác nhau không đáng kể khi dùng cùng mức liều trong cùng điều kiện thử
nghiệm.
Mức độ hấp thu dược chất từ các chế phẩm dùng đường uống hoặc dùng tại chỗ có
thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố. Trong đó, các yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến quá
trình hấp thu như kỹ thuật sản xuất, kích thước hạt, dạng tinh thể của dược chất, các
tá dược như: tá dược độn, dính, rã, trơn, bao, tá dược làm tăng độ tan, tá dược gây
tác dụng kéo dài Sinh khả dụng là một chỉ số quan trọng đảm bảo chất lượng thực
của sản phẩm, và tương đương sinh học là cơ sở chủ yếu để đảm bảo độ đồng nhất
về chất lượng của cùng một dược chất giữa các chế phẩm khác nhau. Hai khái niệm
này có thể không hoàn toàn giống nhau, nhưng về phương pháp thử nghiệm thì
tương tự. Hướng dẫn này đưa ra một số nguyên tắc cơ bản trong đánh giá sinh khả
dụng và tương đương sinh học để thu được kết quả tin cậy. Chế phẩm thuốc có cần
phải đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học hay không tuỳ thuộc vào quy
định của các cơ quan quản lý.
Những yêu cầu cơ bản của phương pháp phân tích mẫu sinh học.
Các phương pháp sắc ký, như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí (GC)
và các kỹ thuật phối hợp, GC - MS, LC - MS, là những phương pháp tốt nhất được
sử dụng trong nghiên cứu sinh khả dụng và đánh giá tương đương sinh học. Những
phương pháp này có tính đặc hiệu cao; có khả năng tách và định lượng trên cùng
một hệ thống và cùng thời điểm. Nếu chọn được một detector có độ nhạy thích hợp
sẽ đáp ứng được yêu cầu phân tích các loại mẫu sinh học. Trong một số trường hợp,
có thể sử dụng phương pháp phân tích sinh hóa và sinh học nếu cần.
Do quá trình phân tích mẫu sinh học bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như lượng mẫu
ít, nồng độ thấp, lẫn nhiều tạp chất là các chất nội sinh (các muối vô cơ, lipid,
protein và chất chuyển hoá) và sự khác nhau giữa các cá thể, nên phương pháp phân

giới hạn định lượng.
4. Giới hạn định lượng: Giới hạn định lượng, hay còn gọi là độ nhạy, là nồng
độ thấp nhất của đường chuẩn có thể xác định được với độ đúng và độ chính
xác cho phép. Giới hạn định lượng ít nhất phải thoả mãn khả năng phân tích
nồng độ của mẫu thử lấy ở thời điểm bằng 3-5 lần thời gian bán thải hoặc
bằng 1/10 đến 1/20 giá trị Cmax của chất phân tích.
5. Độ ổn định của mẫu thử: Độ ổn định của mẫu sinh học có chứa chất cần
phân tích cần được khảo sát khi bảo quản ở nhiệt độ phòng, đông lạnh trong
khoảng thời gian khác nhau để xác định điều kiện bảo quản và thời gian bảo
quản mẫu sau khi lấy.
6. Hiệu xuất chiết: Khả năng tìm lại sau khi chiết được đánh giá với ít nhất 3
nồng độ: cao nhất, trung bình và thấp nhất của đường chuẩn. Chỉ tiêu giới
hạn có thể tham khảo những tài liệu liên quan.
7. Mẫu chuẩn đối chiếu (QC): Mẫu chuẩn đối chiêú được dùng để so sánh khi
định lượng là những mẫu tự tạo biết trước nồng độ, chuẩn bị bằng cách pha
chất chuẩn của chất cần phân tích trong mẫu sinh học trắng.
8. Phân tích mẫu thử: Định lượng các mẫu thử bằng phương pháp phân tích đã
được thẩm định. Mỗi mẫu thử có thể phân tích 1 lần hoặc lặp lại nếu cần. Với
mỗi lô mẫu phân tích sinh học (các mẫu phân tích cùng một thời gian trong
một buổi hoặc ngày), nên thiết lập một đường chuẩn mới để phân tích và
dùng các mẫu QC với 3 nồng độ (thấp, trung bình và cao) để định lượng
đồng thời trong mỗi lô phân tích. Nói chung, độ lệch giữa các kết quả của
mẫu chuẩn đối chiếu không được quá 20%.
Qui định chung:
1. Lựa chọn người tình nguyện:
Tiêu chuẩn: trong nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học, đa số
trường hợp thường chọn người tình nguyện là nam giới khoẻ mạnh. Một số
trường hợp cần thiết có thể dùng đối tượng là phụ nữ, khi đó cần giải thích rõ.
Với thuốc dùng cho trẻ em, vẫn nên chọn người lớn để thử nghiệm. Các tiêu
chuẩn cụ thể như sau:

- Khi nghiên cứu sinh khả dụng tương đối hoặc tương đương sinh học, thuốc
đối chứng thường được chọn là một chế phẩm cùng loại, có uy tín trên thị
trường trong nước hoặc nước ngoài đang được lưu hành.
3. Chế phẩm thử: chế phẩm thử phải đạt các yêu cầu chất lượng theo tiêu chuẩn và
yêu cầu trong thực hành lâm sàng. Phải có đủ các dữ liệu in vitro về độ hoà tan, độ
ổn định, hàm lượng hoặc hoạt lực. Đối với chế phẩm đặc biệt, cần phải có thêm
những tài liệu về cấu trúc tinh thể và đồng phân quang học.
4. Thiết kế nghiên cứu: Khi so sánh 2 chế phẩm, tức là thuốc thử và thuốc đối
chứng, người ta thường áp dụng thiết kế chéo, 2 thuốc, 2 giai đoạn. Để hạn chế ảnh
hưởng của sự khác biệt giữa các cá thể và giai đoạn thử nghiệm, các đối tượng
nghiên cứu được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm. Một nhóm sẽ được sử dụng thuốc
thử trước và thuốc chứng sau; ngược lại, nhóm kia sử dụng thuốc chứng trước và
thuốc thử sau. Giữa 2 giai đoạn thử, cần có một khoảng thời gian để đảm bảo cho
thuốc của lần thử trước loại hết ra khỏi cơ thể, thường từ 1 đến 2 tuần. Để so sánh 3
chế phẩm: 2 thuốc thử và một thuốc chứng, người ta thường sử dụng nghiên cứu
chéo, 3 thuốc, 3 giai đoạn. Tương tự, thời gian rửa giải cần để loại trừ thuốc ra khỏi
cơ thể giữa các giai đoạn thường từ 1 đến 2 tuần.
Thời điểm lấy mẫu: Thiết kế thời điểm lấy mẫu rất quan trọng để thu được kết quả
nghiên cứu tin cậy. Cần phải lấy một điểm trước khi uống thuốc (mẫu trắng, thời
điểm 0). Một đường cong nồng độ thuốc trong máu hoàn thiện phải bao gồm cả pha
hấp thu, phân bố và thải trừ. Thông thường, ít nhất nên có 4 thời điểm lấy mẫu trước
khi đạt tới đỉnh của đường cong nồng độ – thời gian, 6 hoặc nhiều hơn điểm lấy
mẫu sau đỉnh, 3 giá trị xung quanh đỉnh của đường cong, tổng số điểm lấy mẫu nên
nhiều hơn 11. Thời gian lấy mẫu nên kéo dài tới khoảng 3 – 5 lần thời gian bán thải
của dược chất hoặc khi nồng độ trong máu thấp hơn 1/10 – 1/20 giá trị Cmax. Mẫu
máu (huyết tương, huyết thanh hay máu toàn phần) phải bảo quản đông lạnh ngay
sau khi lấy để chờ phân tích.
Khi không thể xác định được nồng độ thuốc trong huyết tương, có thể thực hiện trên
một mẫu sinh học khác như nước tiểu, nhưng chất xác định được và phương pháp
phân tích phải phù hợp với những yêu cầu về đánh giá sinh khả dụng.

0-∞
(diện
tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ thời điểm 0 đến vô cùng) được tính
toán theo công thức:
AUC
0-∞
= AUC
0-tn
+ C
tn
/ z, trong đó C
tn
là nồng độ của thuốc tại thời điểm lấy mẫu
cuối cùng, và z là hằng số tốc độ thải trừ. T
1/2
có thể được tính bằng công thức:
T
1/2
= 0,693/ z, trong đó z được tính từ độ dốc của đoạn tuyến tính trên đường
biểu diễn logarit nồng độ - thời gian.
AUC
o-tn
từ thời điểm 0 đến thời điểm cuối cùng phải thoả mãn:
AUC
o-tn
/ AUCo-∞ x 100% > 80%.
8. Tính toán sinh khả dụng
(1) Dùng đơn liều: Sinh khả dụng F được tính toán lần lượt bằng cách sử dụng
AUC
0-tn

R
/(AUC
0-tn
)
R
x D
T
] x 100%
F= [(AUC
0-∞
)
T
x D
R
/(AUC
0-∞
)
R
x D
T
] x 100%
Trong đó, DR và DT là liều uống của thuốc chứng và thuốc thử, tương ứng.
Phân tích các chất chuyển hoá: Một vài thuốc là dạng tiền chất của thuốc không thể
định lượng được trong máu vì dạng tiền thuốc chuyển hoá rất nhanh trong cơ thể.
Sinh khả dụng của những loại thuốc này có thể được đánh giá qua đáp ứng thích
hợp của chất chuyển hoá có hoạt tính.
F = [(AUC
0-tn
)
m

0-∞
được dùng như một
đối chứng.
(2) Dùng đa liều: Nếu trạng thái ổn định đạt được sau khi uống nhiều liều, sinh khả
dụng có thể được ước tính bằng trung bình nồng độ thuốc trong huyết tương ở trạng
thái ổn định.
a. Mức độ hấp thu của thuốc tương tự nhau, nhưng có thể khác về tốc độ hấp
thu.
b. Sinh khả dụng giữa các cá thể khác nhau nhiều.
c. Thuốc giải phóng có kiểm soát, tác dụng kéo dài
d. Sau khi uống liều đơn, nồng độ của thuốc dưới dạng tiền chất của thuốc
hoặc chất chuyển hoá thấp, không thể xác định được bởi phương pháp phân tích
thích hợp.
Sau khi uống đa liều với cách khoảng thời gian t bằng nhau có thể đạt tới trạng thái
ổn định, lấy mẫu máu nhiều lần trong quá trình uống thuốc. Phân tích xác định nồng
độ thuốc và tính giá trị AUC
ss
0-t
. Khi liều của thuốc thử giống thuốc đối chứng, sinh
khả dụng tương đối có thể được tính toán theo biểu thức:
F = (AUC
ss
t
/ AUC
ss
R
) x 100%
Trong đó, AUC
ss
t

(4) Trình bày số liệu:
a. Trình bày đầy đủ số liệu nồng độ thuốc trong huyết tương ở các thời điểm
của từng cá thể, giá trị trung bình và độ lệch chuẩn, các bảng và biểu đồ của
đường biểu diễn.
b. Tính các thông số Cmax, Tmax, AUCo-tn, AUCo-∞, F, các giá trị trung bình
và độ lệch chuẩn. Ngoài ra, nên trình bày thêm một số thông số khác như
thời gian lưu trú trung bình (MRT).
(5) Đánh giá tương đương sinh học: Khi so sánh thuốc thử và thuốc đối chứng
đều là chế phẩm giải phóng có kiểm soát hoặc tác dụng kéo dài, 2 thuốc
được coi là tương đương sinh học với nhau nếu giá trị AUC và Cmax đáp
ứng yêu cầu về tương đương sinh học, và giá trị Tmax khác biệt không có ý
nghĩa thống kê. Khi so sánh thuốc thử là chế phẩm giải phóng có kiểm soát
hoặc kéo dài với thuốc chứng là chế phẩm qui ước, mức độ hấp thu của 2
thuốc là tương đương sinh học nếu giá trị AUC đáp ứng được những yêu cầu
của tương đương sinh học (80% -125%) và thuốc thử có khả năng giải phóng
có kiểm soát hoặc kéo dài, nếu như giá trị Cmax giảm và Tmax kéo dài hơn
thuốc qui ước.
2. Nghiên cứu đa liều, thử chéo 2 giai đoạn: Mục tiêu của nghiên cứu là tìm tốc
độ và mức độ hấp thu, khoảng dao động của nồng độ thuốc trong máu ở trạng
tháí ổn định sau khi uống nhiều lần.
(1) Người tình nguyện và tiêu chuẩn lựa chọn.
Việc lựa chọn người tình nguyện cũng giống như trong nghiên cứu đơn liều,
những người đã tham gia nghiên cứu đơn liều cũng có thể tiếp tục được sử dụng
trong nghiên cứu đa liều. Số lượng người tình nguyện cần thiết khoảng từ 12-24.
Lựa chọn thuốc đối chứng cũng tương tự như trong nghiên cứu đơn liều.
(2) Thiết kế và các bước nghiên cứu.
Thiết kế nghiên cứu chéo, ngẫu nhiên và đa liều với cả thuốc thử và thuốc đối
chứng. Đối với thuốc thử, thực hiện nghiên cứu với liều và cách dùng như đã dự
định. Các chế phẩm uống ngày 1 lần, nên uống vào buổi sáng sau khi đã nhịn đói
ít nhất 10h, sau đó không ăn gì trong vòng 2 - 4h sau khi uống thuốc. Với các

Trong đó, AUCss là diện tích dưới đường cong nồng độ thuốc - thời gian từ
thời điểm 0 đến thời điểm t trong suốt khoảng liều ở trạng thái ổn định và t là
khoảng thời gian giữa các lần dùng thuốc.
c. Khoảng dao động của nồng độ thuốc trong máu có thể được tính theo biểu
thức:
DF = 100% x (Cmax - Cmin)/ Cav
Trong đó, Cmax là nồng độ đỉnh, thu được từ các số liệu thực, sau khi dùng
liều cuối cùng ở trạng thái ổn định và Cmin là nồng độ cực tiểu ở thời điểm cuối
trong khoảng thời gian dùng liều cuối cùng ở trạng thái cân bằng.
d. Phân tích thống kê và đánh giá tương đương sinh học: Phương pháp phân
tích thống kê và đánh giá tương đương sinh học tương tự như đã trình bày trong
nghiên cứu đơn liều của thuốc tác dụng kéo dài, thuốc giải phóng có kiểm soát.