ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
******* HUỲNH HỒNG KHÁNH THƯ TÌM HIỂU TÍNH KHÁNG THUỐC
ANTIRETROVIRUS (ARV) CỦA VIRÚT HIV
TRÊN CÁC BỆNH NHÂN NHIỄM HIV
Chuyên ngành: Di truyền học – Khoa Sinh học
Mã số:
604270
LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUN NGÀNH DI TRUYỀN
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trương Thò Xuân Liên
ii
1.10. Tác động của thuốc và cơ chế kháng thuốc 15
1.11. Điều trò kháng retrovirút 24
1.12. Hiện tượng thất bại điều trò 25
1.13. Các phương pháp nghiên cứu tính kháng thuốc ARV ở HIV-1 32
1.14. Bối cảnh thực hiện của đề tài 35
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. Mục tiêu nghiên cứu 38
2.2. Phương pháp tiến hành 41
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tìm hiểu mức độ lan truyền các chủng HIVKT trong cộng đồng 46
3.1.1 Một số đặc điểm của nhóm nghiên cứu 46
3.1.2. Tình trạng kháng thuốc trên nhóm bệnh nhân mới nhiễm chưa
điều trò 48
3.1.3. Đònh týp di truyền 51
3.2. Kháng thuốc trên nhóm bệnh nhân thất bại điều trò 54
3.2.1. Một số đặc điểm của nhóm nghiên cứu 55
3.2.2. Đặc điểm bệnh nhân khi bắt đầu điều trò tại phòng khám ngoại trú
(OPC) 56
3.2.3. Tình hình điều trò của bệnh nhân trước khi đến OPC 57
3.2.4. Đặc điểm sử dụng ARV tại các OPC 58
3.2.5. Tuân thủ điều trò 59
Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15
iii
3.2.6. Chỉ đònh thất bại điều trò 59
3.2.7. Tình trạng bệnh nhân tại thời điểm thực hiện xét nghiệm kháng
thuốc ARV 60
3.2.8. Đặc điểm kháng thuốc cảu bệnh nhân có nồng độ virút tự do trong
ARV
Antiretrovirus
(Thuốc kháng retrovirút)
ATV Atazanavir
AZT Zidovudine
D4T Stavudine
ddI Didanosine
DLV Delavirdine
DNA Deoxyribonucleic acid
DRV Darunavir
EFV Efavirenz
ETV Etravirenz
FPV Fosamprenavir
FTC Emtricitabine
gp Glycoprotein
HAART
High Active Antiretrovirus Therapy
(Điều trị kháng retro vi rút hiệu lực cao)
HIV
Human Immunodeficiency Virus
(Vi rút gây suy giảm miễn dòch ở người)
HIVKT
HIV kháng thuốc
IC
Inhibitor Concentration
(Nồng độ ức chế)
IDV Indinavir
KTC 95% Khoảng tin cậy 95%
Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15
(Phản ứng phiên mã ngược tổng hợp chuỗi)
SQV Saquinavir
TDF Tenofovir
Tp. HCM Thành phố Hồ Chí Minh Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Các loại thuốc kháng retrovirút 12
Bảng 1.2: Các đột biến kháng thuốc nhóm NRTI 16
Bảng 1.3: Các đột biến kháng thuốc nhóm NNRTI 19
Bảng 1.4: Các đột biến kháng thuốc nhóm PI 21
Bảng 1.5: Các phác đồ bậc 1 được sử dụng trên thế giới 24
Bảng 1.6: Các phác đồ được sử dụng tại Việt Nam 25
Bảng 1.7: Các tiêu chí đánh giá thất bại điều trò 26
Bảng 3.1: Đặc điểm dân số xã hội của nhóm nghiên cứu 46
Bảng 3.2: Đặc điểm tải lượng virút của nhóm đối tượng nghiên cứu 48
Bảng 3.3: Đặc điểm của nhóm bệnh nhân thất bại điều trò ARV 54
Bảng 3.4: Kiến thức của bệnh nhân về HIV/AIDS và điều trò ARV 55
Bảng 3.5: Đặc điểm bệnh nhân khi bắt đầu điều trò 56
Bảng 3.6: Mức độ xuất hiện các đột biến TAM 64
Bảng 3.7: Phân tích đơn biến một số yếu tố liên quan đến tình trạng kháng
thuốc 71
Bảng 3.8: Phân tích đa biến một số yếu tố liên quan đến sự xuất hiện HIV
kháng thuốc 73
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Hình 3. 5: Cây phân loại di truyền dựa trên gen reverse trancriptase 53
Hình 3. 6: Đột biến tại vò trí 184 biến đổi methionin thành valin (M184V) 63
Hình 3.7: Đột biến chèn thêm 2 codon xung quanh vò trí 69 (T69i) 64
Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15
1
Tóm tắt
Đặt vấn đề
Điều trò ARV góp phần kéo dài cuộc sống, nâng cao chất lượng sống của
những bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS và giảm sự lây nhiễm trong cộng đồng. Tuy
nhiên cho đến nay đã ghi nhận nhiều trường hợp thất bại điều trò với sự xuất
hiện các chủng HIV mang đột biến kháng thuốc không những hạn chế hiệu quả
điều trò mà còn có nguy cơ làm lan truyền chủng HIVKT trong cộng đồng.
Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu mức độ lan truyền chủng HIVKT trong cộng
đồng (mục tiêu 1) và xác đònh các đột biến kháng thuốc trong nhóm bệnh thất
bại điều trò ARV (mục tiêu 2).
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu tiến hành trên nhóm người mới nhiễm chưa từng tiếp cận ARV
để tìm hiểu mức độ lan truyền của các chủng HIVKT trong cộng đồng và nhóm
bệnh nhân đang điều trò được đánh giá thất bại dựa theo tiêu chuẩn lâm sàng
hoặc miễn dòch.
Tại thời điểm thực hiện xét nghiệm kháng thuốc, nồng độ HIV-RNA tự do
trong máu được xác đònh bằng kỹ thuật real-time PCR (Biocentric). Các mẫu có
nồng độ virút ≥1000 bản sao/mL (3log
bản sao/mL
) sẽ được giải trình tự các gen
reverse transcriptase và protease liên quan đến đích tác động của thuốc ARV.
Các đột biến kháng thuốc sẽ được phân tích bằng chương trình CEQ
TM
nghiệm kháng thuốc trung bình là 19 tháng. Đánh giá thất bại điều trò chủ yếu
dựa vào các chỉ tiêu miễn dòch học (75,1%) và/hoặc kết hợp với các tiêu chí lâm
sàng (10,5%). Khi bắt đầu điều trò ARV, 94,2% bệnh nhân được điều trò theo
phác đồ bậc 1, trong đó d4T/3TC/NVP chiếm 63,0%.
107 (61,8%) bệnh nhân có nồng độ HIV-RNA ≥ 3log
bản sao/mL
được làm xét
nghiệm phát hiện HIV kháng thuốc. Kết quả phân tích cho thấy, 87,9% mang ít
nhất 1 đột biến kháng chính với tỷ lệ kháng nhóm NRTI và NNRTI rất cao
(86,0% và 84,1%). Kháng nhóm PI chỉ tìm thấy trên 3,7% quần thể nghiên cứu.
Đối với nhóm NRTI, sự chọn lọc các đột biến chính M184V (85,9%), Q151M
(14,1%), T69i (6,5%) và các đột biến TAMs (57,6%) đã dẫn đến tình trạng
Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15
3
kháng với phần lớn các thuốc trong nhóm. Trong nhóm NNRTI, kháng chéo đã
xảy ra với hầu hết các thuốc và có tần suất khá cao (Y181I/C/V 51,1%, G190A
37,8%, K103N/S 34,4% v.v ). Đột biến M46L/IM và V82AV gây tính kháng
nhóm PI được tìm thấy trên 3,7% bệnh nhân.
Sau khi phân tích hồi qui tương quan đa biến, một số các yếu tố liên quan
đến tình trạng kháng thuốc, bao gồm: có ít nhất 1 lần không tuân thủ tốt điều trò
(OR hiệu chỉnh 2,6; KTC 95% 1,1 – 6,0, p 0,02), thời gian điều trò trên 2 năm
(OR hiệu chỉnh 2,5; KTC 95% 1,1 – 5,8, p 0,03) và tiền sử dùng phác đồ ít hơn 3
thứ thuốc (OR hiệu chỉnh 4,4, KTC 95% 1,1 – 17,3, p 0,03).
HIV tái tổ hợp CRF01_AE là thứ type di truyền chính trong nghiên cứu này.
Kết luận
Tỷ lệ HIV kháng thuốc trong cộng đồng ở mức thấp 2,7% (<5%) có thể do
việc mới tiếp cận ARV tại Việt Nam. Trong nhóm bệnh nhân thất bại điều trò
ARV, tỷ lệ có đột biến kháng thuốc là khá cao (87,9%) đối với các thuốc trong
độ virút trong máu, cải thiện tình trạng suy giảm miễn dòch do đó làm giảm tỷ lệ
mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội, kéo dài và cải thiện chất lượng cuộc sống cho
người bệnh, đồng thời cũng làm giảm nguy cơ lây nhiễm trong cộng đồng.
Tuy nhiên, sự xuất hiện các chủng virút mang đột biến kháng thuốc là một
trong những nguyên nhân dẫn đến thất bại trong điều trò, không những hạn chế
hiệu quả điều trò mà còn làm lan truyền các chủng HIV kháng thuốc. Virút HIV
có tính đa biến di truyền cao (khoảng 10 triệu virút có một đột biến mới/ngày)
do tốc độ nhân lên rất nhanh (10 tỷ virút mới trong một ngày) và men phiên mã
ngược không có khả năng sửa lỗi trong quá trình sao chép
[50]
. Một số các đột
biến trên các gen RT hoặc Protease có liên quan đến tính kháng ARV. Dưới áp
lực của thuốc ARV, các chủng virút mang đột biến kháng thuốc sẽ chiếm ưu thế
tồn tại, dẫn đến tình trạng kháng thuốc và lan truyền chủng kháng thuốc. Sự
Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15
5
kháng thuốc phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại thuốc sử dụng, phác đồ điều trò
ARV, sự tuân thủ của bệnh nhân, liều lượng thuốc, sự ngưng thuốc, Ngoài ra
tính kháng thuốc còn phụ thuộc vào các yếu tố của virút như số lượng đột biến
cần để làm cho chúng trở nên kháng với các loại ARV, các týp di truyền của
virút. Virút HIV-2 và các virút HIV-1 nhóm O có tính kháng thuốc tự nhiên với
một số thuốc ARV. Trong các nghiên cứu in vitro, HIV-2 có thể có thể đề kháng
với một số thuốc ức chế men protease như Amprenavir và Atazanavir. Tính đa
dạng di truyền của virút HIV có thể cũng có ảnh hưởng đến khả năng đề kháng
với các loại ARV.
Phác đồ điều trò ARV cần uống đều đặn, đúng giờ và kéo dài suốt đời, do
đó đòi hỏi sự tuân thủ rất cao của bệnh nhân cùng với các dòch vụ y tế theo dõi
chăm sóc người bệnh, cung cấp thuốc, thực hiện các xét nghiệm sinh học trong
7
1.1. Đặc điểm sinh học của HIV:
HIV, tác nhân gây hội chứng suy giảm miễn dòch mắc phải (AIDS), là
một Retrovirút thuộc họ Lentivirút. HIV có vật liệu di truyền là RNA, trong quá
trình nhân lên phải trải qua giai đoạn trung gian phiên mã phân tử RNA thành
DNA sợi đôi nhờ enzyme phiên mã ngược RT (reverse transcriptase) của virút.
Do đặc tính này cũng như do tốc độ nhân lên nhanh, HIV dễ tạo các đột biến gen
và mang tính đa biến di truyền cao. Có hai loại virút là HIV-1 và HIV-2, trong
đó HIV-1 là tác nhân gây bệnh thường gặp nhất trên toàn thế giới. HIV-2, chủ
yếu lưu hành ở các nước châu Phi, ít gặp và có độc lực thấp hơn, thời gian
chuyển từ nhiễm virút sang giai đoạn bệnh dài hơn nhưng vẫn có biểu hiện lâm
sàng ở giai đoạn AIDS như HIV-1.
1.2. Cấu trúc hình thể của HIV-1
[9], [14]
HIV-1 có cấu trúc hình khối cầu, với đường kính khoảng 100nm. Bên
ngoài là lớp màng đôi lipid có nguồn gốc từ tế bào chủ và các gai có bản chất là
glycoprotein (gp120 và gp41) được mã hóa bởi bộ gen virút. Bên trong có vỏ
capsid và các protein lõi p17, p24, p7 và p6. Các protein này bao quanh bộ gen
của HIV-1 gồm 2 sợi RNA (+) được gắn với nhiều phân tử enzyme cần thiết cho
quá trình nhân bản: men phiên mã ngược (RT), men xâm nhập (integrase – p32)
và protease – p11.
Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15
8
Hình 1.1: Cấu trúc hình thể của HIV-1
b. Các protein được mã hóa từ gen gag, pol và env.
1.4. Chu trình nhân lên của virút HIV và những vò trí tác động của các
phân tử thuốc kháng Retrovirút
Sự nhân lên của HIV-1 được diễn ra trong các tế bào đích chủ yếu là các tế
bào lympho TCD4 và một số tế bào khác có thụ thể CD4. Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15
10
Hình 1.3:
Chu trình nhân lên của HIV-1
[52]
a. Giai đoạn hòa màng tế bào.
b. Giai đoạn sao chép ngược và tổng hợp
RNA virút.
c. Giai đoạn đóng gói và nảy chồi.
Quá trình nhân lên của virút HIV có thể tóm tắt trong các bước sau:
• Virút gắn và xâm nhập vào tế bào đích:
Phân tử gp120 của virút gắn lên thụ thể CD4 (có trên bề mặt tế bào lympho
TCD4 và một số tế bào khác) và các đồng thụ thể (CCR5 hoặc CXCR4) của tế
bào đích, nhờ đó dẫn đến sự thay đổi cấu hình không gian và làm bộc lộ vò trí tác
động của phân tử gp41 tham gia trong quá trình hòa màng giữa virút và tế bào
đích. Nucleocapside của virút sẽ được phóng thích vào trong tế bào chất.
• Quá trình sao chép RNA thành DNA tiền virút
Sau khi có sự cởi bỏ vỏ capside, nhờ có enzyme phiên mã ngược RT, RNA
của virút được sao chép thành DNA bổ sung sợi đơn và sau đó thành sợi đôi.
Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15
- Ức chế quá trình cắt các protein tiền virút thành các protein cấu trúc và chức
năng: thuốc ức chế protease.
1.5. Các thuốc kháng retrovirút
Các loại thuốc kháng retrovirút (ARV) hiện đang lưu hành có thể chia thành 5
nhóm chính dựa vào cơ chế tác động của chúng, cụ thể được liệt kê trong bảng I.1.
Bảng 1.1: Các loại thuốc kháng retrovirút
Nhóm thuốc Thuốc Cơ chế tác động
Thuốc ức chế men
phiên mã ngược NRTI
Lamivudin
Stavudin
Zidovudin
Emtricitabin
Didanosin
Abacavir
Tenofovir
3TC
d4T
AZT
FTC
ddI
ABC
TFV
Cạnh tranh với các nucleotit tự
nhiên gắn xen vào mạch DNA
đang tổng hợp, ức chế men RT
kéo dài chuỗi.
Thuốc ức chế men
phiên mã ngược
NNRTI
nhập virút vào bộ gen
tế bào đích
Raltegravir
Elvitegravir
MK-
0518
GS-
9137
Ức chế sự sát nhập DNA virút
vào DNA bộ gen của tế bào chủ.
Thuốc ức chế hòa
màng
Enfuvirtide T-20 Ngăn cản sự hòa màng của virút
vào tế bào chủ
Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15
13
Hình 1. 4: Các vò trí tác động của thuốc ARV
[48]
1.6. Hiện tượng kháng thuốc ARV
Sự kháng thuốc ARV của HIV được xác đònh khi có sự hiện diện các đột
biến mang tính kháng thuốc ARV so với chủng HIV hoang dại nhạy cảm với
thuốc. Đây là những đột biến tự nhiên trong các gen mã hóa cho các phân tử
đích mà thuốc tác động (gen reverse transcriptase, gen protease hay
integrase ). Dưới áp lực chọn lọc của thuốc ARV, virút mang các đột biến
kháng thuốc dần dần chiếm ưu thế tồn tại và dẫn tới sự kháng thuốc
1.7. Hiện tượng kháng chéo giữa các thuốc ARV (cross resistance)
quan đến tính kháng đối với thuốc đó. Cách tính điểm dưới đây dựa trên ngân
hàng dữ liệu Stanford – Mỹ:
• Nhạy (<0-9 điểm): virus vẫn còn nhạy với thuốc.
• Có khả năng kháng thấp (10-14 điểm): virus mang những đột biến
chưa có khả năng kháng thuốc nhưng có thể kết hợp với nhiều đột biến
khác gây nên tính kháng.
Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15
15
• Kháng thấp (15-29 điểm): virus giảm mức độ nhạy cảm với thuốc, bệnh
nhân có thể đáp ứng không tốt về mặt virus khi điều trò.
• Kháng trung bình (30-59 điểm): virus thể hiện khả năng kháng với
thuốc làm giảm hiệu quả điều trò.
• Kháng cao (>= 60 điểm): virus mang tính kháng cao với thuốc và bệnh
nhân không đáp ứng điều trò về mặt virus học.
1.10. Tác động của thuốc và cơ chế kháng thuốc
1.10.1. Đối với hai nhóm thuốc ARV can thiệp quá trình phiên mã ngược
của HIV-1
[1], [10], [13], [34]
a. Nhóm thuốc nucleoside (NRTI – Nucleoside reverse transcriptase inhibitor):
• Cơ chế tác động của thuốc
Đây là những nucleotit không mang phân tử đường ribo-triphosphat, hoạt
động dựa vào cơ chế cạnh tranh với các nucleotit tự nhiên để gắn xen vào sợi
DNA đang được tổng hợp bổ sung với RNA mạch khuôn. Khi các phân tử thuốc
gắn vào sợi DNA đang được tổng hợp, quá trình tổng hợp sẽ bò ngưng trệ vì
không thể hình thành được liên kết photphodieste để kéo dài chuỗi xoắn kép
DNA. Các thuốc NRTI là các “tiền chất”, tức chúng được hấp thu dưới dạng
nguyên thủy và chỉ được hoạt hóa sau khi gắn thêm 3 gốc phosphat nhờ quá trình
phosphorin hóa nội bào. Chính dạng triphosphat này mới là dạng có hiệu lực.
Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15
Copyright: Tài liệu đại học ©