XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HOÁ SINH VÀ
SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG BACILLUS
THURINGIENSIS VAR. AIZAWAI H1 PHÂN LẬP Ở
VIỆT NAM

Bùi Thị Hương, Nguyễn Thuỳ Châu
Bộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu Hoạch
Đinh Duy Kháng
Phòng Vi Sinh phân tử, Viện Công Nghệ Sinh Học

Bacillus thuringiensis (gọi tắt là Bt) là vi khuẩn gram
dương được phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, chúng chứa
các gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố
có khả năng diệt nhiều loại côn trùng, vì thế chế phẩm
thuốc trừ sâu vi sinh Bt đã được sử dụng để phòng trừ các
côn trùng dịch hại thuộc các bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ
cánh cứng và các động vật không xương sống khác. Trong
những năm gần đây các nhà khoa học đã tập trung nghiên
cứu, sưu tập, phân tích và sàng lọc các chủng B.
thuringiensis thu nhận được ở các mẫu phân lập từ môi
trường, với mục đích tìm ra những chủng mới có hoạt tính
diệt sâu cao, phổ diệt sâu rộng đối với nhiều loài côn trùng.
Việc xác định sự tồn tại các nguồn gen quý từ những chủng
này là công việc rất cần thiết, làm cơ sở tiền đề cho các
nghiên cứu đi sâu tiếp theo đối với những gen cry này như:
việc gây đột biến vị trí có định hướng đối với gen cry nhằm
tạo chủng B. thuringiensis mới chống khả năng kháng
thuốc của các loại côn trùng; việc tạo ra các chủng B.
thuringiensis tái tổ hợp mới có phổ diệt sâu rộng, hoạt lực
diệt sâu cao hơn đối với nhiều loài côn trùng quan trọng;
việc biến nạp các gen độc tố cry thích hợp vào từng loại

chủng B. thuringiensis var. aizawai H1

Chủng B. thuringiensis phát triển trên môi trường thạch T3
đã được tạo hỗn dịch trong 5 ml dịch 0,02% Triton X-100.
Ly tâm trong 1 phút. Cắn được hoà tan với 30 l đệm SDS
(1x SDS gel- loading buffer). Các mẫu được đun sôi trong
5 phút, ly tâm ở 8000vòng/phút trong 5 phút, lấy dịch nổi
và chạy điện di trên gel polyacryamide 10% ở 30mA theo
phương pháp của Sambrook và Maniatis [5].

I.3. Xác định sự tồn tại gen cry1Ab, cry1C bằng kỹ thuật
PCR.

Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25l đựng
trong ống Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khử
ion 13,6l, dNTP 2,5l, buffer 2,5l, primer 2l, enzim
Tag-polymeraza 0,4l, MgCl2: 2l, ADN 2l ( nồng độ
50ng/l).

Sử dụng cặp mồi TY6(5’-
GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) và
TY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’); TYIC
(5’-CAACCTCTATTTGGTGC AGGTTC-3’) và TYIUNI
(5’-ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC-
3’) theo thứ tự, để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong
gen cry1Ab và cry1C. Các sản phẩm PCR được phân tích
bằng điện di trên gel agaroza 1%.

I.4. Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1C.



II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

II.1. Thử sinh học hoạt tính diệt sâu của chủng B.
thuringiensis var. aizawai H1 phân lập

Chủng B. thuringiensis phân lập đã được phân loại là chủng
B. thuringiensis var. aizawai theo phương pháp định typ
huyết thanh của Ohba và Aizawai [1].

Chúng tôi đã tiến hành thử sinh học hoạt tính diệt sâu của
chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập có tinh thể
hình quả trám đối với một số côn trùng phổ biến thuộc bộ
cánh vảy như sâu ngài gạo, sâu tơ, sâu keo, sâu khoang và
sâu bông kết quả được chỉ ra ở bảng 1:
Bảng 1: Hoạt tính diệt sâu của các chủng B. thuringiensis
var. aizawai H1 phân lập đối với sâu tơ (Plutella
xylostella), sâu keo (Spodoptera exiqua), sâu khoang
(Spodoptera litura), sâu bông (Helicoverpa armigera) và
sâu ngài gạo (Corrcyra cephalonica)
Kết quả bảng 1 cho thấy: chủng B. thuringiensis var.
aizawai H1 phân lập có hiệu lực diệt đặc hiệu cao là 100%
đối với sâu ngài gạo, sâu tơ và sâu keo. Hiệu quả diệt giảm
hơn đối với sâu khoang (90%) và giảm hơn nữa trên đối
tượng sâu bông (30%). Như vậy chủng B. thuringiensis var.
aizawai H1 có ý nghĩa rất quan trọng để bổ sung vào bộ
sưu tập chủng giống phục vụ cho công nghệ sản xuất thuốc

aizawai phân lập có khuôn mẫu protein giống với chủng Bt.
var aizawai chuẩn gồm có các băng protein với trọng lượng
phân tử là: 130, 81, 71 kDa.

II.3.Xác định sự tồn tại gen cry1Ab và cry1C của chủng
B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập:

Chúng tôi đã tiến hành sử dụng cặp mồi TYIC và TYIUNI
để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong gen cry1C của
chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập và chủng
chuẩn B. thuringiensis var. aizawai M1, kết quả được thể
hiện ở hình 2

Hình 2. Điện di đồ sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry 1C
của chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập và
chủng chuẩn B. thuringiensis var. aizawai M1

Chú thích: Kênh 1: Sản phẩm PCR chủng chuẩn Bt.
aizawai cắt bằnglM1; Kênh 2: Chỉ thị phân tử (ADN Hind
III và EcoR I) từ trên xuống 21226, 5148, 4973, 4277,
3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp). Kênh 3:
sản phẩm PCR chủng B. thuringiensis var. aizawai H1
phân lập.

Kết quả ở hình 2 cho thấy: sản phẩm PCR thu được rất đặc
hiệu, không có sản phẩm phụ. Chủng B. thuringiensis var.
aizawai H1 phân lập có duy nhất một sản phẩm PCR đặc
hiệu vào khoảng 285bp theo lý thuyết giống với sản phẩm
PCR của chủng chuẩn B. thuringiensis var. aizawai M1
(kênh 1,3). Như vậy cả hai chủng B. thuringiensis var.

Kết quả ở hình 3 cho thấy: khi plasmit tái tổ hợp được cắt
bởi enzim EcoR I đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C được
tách ra khỏi plasmit có kích thước đúng bằng với sản phẩm
PCR của đoạn ADN này ( Kênh 1 và 3, 4, 5, 6). Kênh 2 cho
thấy plasmit của khuẩn lạc xanh không mang đoạn ADN
ngoại lai, và chỉ có một băng duy nhất có kích thước vào
khoảng 3,9kb là trọng lượng phân tử của plasmit. Như vậy
chúng tôi đã chọn được 4 dòng có đính sản phẩm PCR là
đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C và được vi khuẩn E.
coli nhân lên theo mong muốn. Tuy nhiên để khẳng định
một cách chắc chắn điều này, cần xác định trình tự đoạn
ADN đã được gắn vào vectơ.

Hình 3: Điện di trên gel agaroza 1% để kiểm tra các plasmit
tái tổ hợp
mang sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1C cắt bằng
EcoR I.

Chú thích: Kênh 1: Sản phẩm PCR của đoạn ADN đặc hiệu
gen cry1C; Kênh 2: plasmit của khuẩn lạc xanh; Kênh
3,4,5,6: Plasmit cắt bằng EcoR I ; Kênh 7: Chỉ thị phân tử
ADN 1kb leader (12216, 11198, 10180, 9162, 8144, 7126,
6108, 5090, 4072, 3054, 2036, 1636, 1018, 517, 506, 396,
344, 298, 220, 201, 154, 134, 75). II.5. Xác định trình tự nucleotit đoạn ADN đặc hiệu của
gen cry1C.

Kết quả ở hình 4 cho thấy: trình tự đoạn ADN đặc hiệu của

số AC X13602. Độ tương đồng đạt 99,3%. Chúng chỉ khác
nhau bởi 2 nucleotit ở vị trí thứ 122 và 243.

II.7. Dịch mã đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C

Chúng tôi đã tiến hành dịch mã đoạn ADN đặc hiệu của
gen cry1C sang protein nhờ chương trình phần mềm
PC/Gene. Kết quả được thể hiện ở hình 6.

Hình 6: Trình tự các axit amin được dịch mã từ đoạn ADN
đặc hiệu của gen cry1C tạo dòng từ chủng B. thuringiensis
var. aizawai H1 phân lập ở Việt nam.
Kết quả ở hình 6 cho thấy: Đoạn ADN đặc hiệu của gen
cry1C có thể dịch thông sang một đoạn protein có chiều dài
95 axit amin.

III. KẾT LUẬN:

Chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập ở Việt
nam có hiệu lực diệt đặc hiệu cao là 100% đối với sâu ngài
gạo, sâu tơ và sâu keo. Hiệu quả diệt giảm hơn đối với sâu
khoang (90%) và giảm hơn nữa trên đối tượng sâu bông
(30%).

Kết quả điện di protein tinh thể của chủng Bt.aizawai H1
phân lập cho thấy: Khuôn mẫu protein của chủng B.
thuringiensis var. aizawai H1 phân lập giống với chủng

Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
6. 6. Proceeding of the Second Pacific Rim Conference
on Biotechnology of Bacillus thurinsgiensis and its impact
to the environment, Chiangmai, Thailand, Nov. 4-8, 1996.
7. Proceeding of the 2nd Canberra Bacillus thuringiensis
meeting September Lanberra, 1993.
8. Sanchis V; D. Lereclus, G. Menou, J. Chaufaux, S.
Guo, M.M. Lecadet, (1989). "Nucleotide sequence and
analysis of the amino-terminal coding region of the
spodoptera active delta endotoxin gene of Bacillus
thuringiensis aizawai”, Mol. Microbiol. 3, p. 229-238.
9. Schnepf H.E and H.R. Whiteley. (1981), “Cloning and
expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein in E.
Coli Proc Nat”. Acad. Sei. USA, 78: p. 2893-2897.
10. Manual of Technology in Insect Pathodology”. A
academic press, p. 55-57.
11. Wang Fei, Ren Gaixin and Chen Yuehua. (2001),
“Characterisation of Cry- type genes and their insecticidal
crystal protein of 23 specific Bacillus thuringiensis
isolates”. 4th Pacific Rim Conference on the Biotechnology
of Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact,
p.26. SUMMARY

Some biochemical and Biomolecular characteristics of
B. thuringiensis var. aizawai H1 strain isolated in Viet
Nam

pairs of TY6 and TY14; TYIC and TYIUNI respectively
were used to amplified the specific DNA fragments of
cry1Ab gene as well as of cry1C gene by PCR. The PCR
components of 25l of total volum included: 13,6l of
H
2
O, 2,5l of dNTP, 2,5l of buffer, 2l of primer, 0,4l
of Tag-polymeraza enzim, 2l of DNA template (50ng/l).
The PCR conditions were: denaturation at 94
0
C for 3 min,
followed by 30 amplification cycles (94
0
C, 50 sec; 60
0
C, 50
sec; 72
0
C, 1min and 20sec) and extension at 72
0
C for 8
min. The content of 5l of PCR products were analyzed by
electrophoresis on 1% agaroza gel. The result showed that
B. thuringiensis var. aizawai isolate produced only one
PCR product of about 285bp, this result indicated that this
isolate harboured cry1C gene but no cry1Ab gene. The
amplified specific DNA fragment of cry1C gene from B.
thuringiensis var. aizawai H1 isolate was ligated in to
PCR
TM