SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐA HÌNH ADN (PCR-
RFLP) TRÊN VÙNG INTRON 18 ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁ
THỂ MANG GEN BỆNH MÁU KHÓ ĐÔNG
HEMOPHILIA A

Lê Nhật Minh
1
, Lê Thị Kim Tuyến
1
, Võ Thị Thương
Lan
2
, Đỗ Trung Phấn
3

1
Phòng sinh học phân tử, Viện Vệ sinh dịch tễ TW.
2
Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
3
Viện Huyết học và truyền máu TW

Tóm tắt: 9 bà mẹ của 9 bệnh nhân nam mắc bệnh
Hemophilia A (trong đó có trường hợp một mẹ và hai con
trai mang bệnh) được phân tích tính đa hình ADN của vùng
Intron 18 trên gen mã cho yếu tố VIII bằng enzym giới hạn
Bcl I. Kết quả phân tích cho thấy 4/9 bà mẹ (44.44%) mang
cặp alen dị hợp tử XhX về bệnh máu khó đông và truyền
bệnh cho con trai mình tạo thành dạng XhY gây bệnh.

MỞ ĐẦU

2. Phương pháp:

a. ADN được tách từ máu theo phương pháp sử dụng nồng
độ muối cao. [ ]

b. Phản ứng PCR: một ống 50l gồm có: 5l ADN khuôn;
5l dNTPs 10mM; 1,5mM MgCl
2
; 0,5 U Taq; 0,8 nM mỗi
loại mồi; 5l đệm PCR. 50l mỗi ống được làm phản ứng
PCR trên máy Amp Gen 9700 với chương trình 94
o
C- 7’;
30 chu kỳ: 94
o
C - 1’; 58
o
C-1’’; 72
o
C -1’; 72
o
C 10 phút;
40C-20’. 40nM ADN mồi với trình tự của đôi mồi là:

8.1: 5’ TAAAAGCTTTAAATGGTCTAGGC 3’
8.2: 5’ TTCGAATTCTGAAATTATCTTGTTC 3’

c. Cắt sản phẩm PCR với enzym giới hạn: 1l BclI; 3l
đệm enzym NBE3 (New England Biolab) và 25l sản
phẩm PCR

thể X bình thường (không có đột biến) có một vị trí nhận
biết của enzym giới hạn BclI tại nucleotit thứ 99. Do đó nó
sẽ bị cắt thành hai đoạn ADN có chiều dài tương ứng là 99
bp và 43 bp. Vạch ADN nhỏ 43bp thể hiện mờ hơn trên gel
vì độ phát sáng của phương pháp nhuộm bạc tương đương
với trọng lượng phân tử ADN. Sự có mặt rõ ràng của vạch
99bp đủ để xác định không có đột biến. Khi xảy ra đột biến
điểm làm thay đổi trình tự tại vị trí nhận biết của BclI, đoạn
ADN không bị cắt và giữ nguyên chiều dài 142 bp. Như
vậy tính đa hình độ dài các đoạn ADN cắt với enzym giới
hạn BclI (PCR-RFLP) gồm các đoạn ADN có kích thước
142 bp; 99 bp và 43 bp. Trên cơ sở đó có thể phân tích kết
quả xét nghiệm của một số cặp mẹ con (Hình 2)

Hình 2: Kết quả điện di và phân tích RFLP. M1: ADN
chuẩn X174 HaeIII; M2: ADN chuẩn pBR 322 MspI. 1-2:
cặp mẹ con thứ 1; 3-4: cặp mẹ con thứ 2; 5-6: cặp mẹ con
thứ 3; 7-8: cặp mẹ con thứ 4 1. Ở cặp mẹ con thứ nhất (1: người con trai; 2: người
mẹ) và thứ tư (7: người con trai; 8: người mẹ) cho thấy tính
đa hình độ dài các đoạn giới hạn với enzym Bcl I (PCR-
RFLP) ở người mẹ thể hiện ba đoạn ADN có kích thước
142bp, 99bp và 43bp. Theo kết quả RFLP của hai người mẹ
này thì đột biến xảy ra trên một nhiễm sắc thể giới tính X
tại vùng không mã hoá intron 18, thuộc đoạn ADN dài
142bp được nhân lên bằng phản ứng PCR. Đột biến này
tương ứng với sự thay đổi nucleotit làm mất vị trí nhận biết
của enzym giới hạn BclI. Kết quả là đoạn ADN dài 142 bp

hình ở người con có hai đoạn ADN 99 bp và 43 bp. Kết quả
này chỉ ra rằng nhiễm sắc thể X là bình thường với chỉ thị
enzym giới hạn BclI. Tuy nhiên kết hợp thông tin lâm sàng,
người con trai bị bệnh máu khó đông Hemophilia A như
vậy là nhiễm sắc thể X của người con trai này phải là
không bình thường. Kiểu gen X
h
Y biểu hiện bệnh là do
nhận một nhiễm sắc thể X tổn thương từ mẹ nhưng đột biến
không xẩy ra ở vị trí của BclI mà ở vị trí khác. Điều này
cũng phù hợp khi phân tích tính đa hình của người mẹ chỉ
có hai đoạn ADN là 99 bp và 43 bp. Như vậy cả hai nhiễm
sắc thể X của người mẹ này là bình thường ở vị trí BclI.
Muốn có những kết luận chính xác về tình trạng bệnh máu
khó đông của cặp mẹ con này cần tiến hành thêm ở những
chỉ thị khác làm thêm một số chỉ thị khác như enzym giới
hạn XbaI trên vùng không mã hoá intron 22, enzym giới
hạn HindIII trên vùng không má hoá intron 19, enzym giới
hạn BglI trên intron 25… Nếu kết quả phân tích tính đa
hình trên cặp mẹ con này cũng cho những kết quả tương tự
như khi phân tích với BclI có thể đưa đến một kết luận
khác: nhiễm sắc thể X của mẹ là hoàn toàn bình thường,
bệnh máu khó đông ở người con trai này có thể là do đột
biến tự phát xảy ra trong quá trình hình thành tế bào sinh
dục (ở người mẹ) như các đột biến mất đoạn hay đột biến
điểm. Tuy nhiên tỷ lệ của các đột biến tự phát thường
không cao.

3. Kết quả phân tích đa hình trên Hình 2 của cặp mẹ con
bệnh nhân thứ hai (3: con trai và 4: người mẹ) chỉ có một

Trong những trường hợp như vậy một trong những hướng
suy nghĩ tiếp theo mà chúng tôi mong muốn được tiến hành
là xác định trình tự đoạn ADN này.

Tổng hợp lại có 4/9 (44,44%) bà mẹ xác định được rõ ràng
sự di hợp tử về bệnh Hemophilia A (X
h
X) và truyền gen
bệnh đột biến trên vùng intron 18 liên quan với enzym giới
hạn BclI sang cho con của mình. Tỉ lệ này cũng tương
đương với các quần thể dân cư khác trong khu vực như
Trung Quốc, Nhật Bản. 3/9 trường hợp (33.33%) đột biến
không xẩy ra trên intron 18 làm mất vị trí nhận biết của
enzym giới hạn Bcl I. Còn lại 2/9 (22,22%) chưa có những
kết luận chính xác và cần phải tiến hành các thí nghiệm
khẳng định khác. Ở đây chúng tôi mới bước đầu xây dựng
và triển khai một phương pháp sinh học phân tử để chẩn
đoán bệnh Hemophilia A. Bệnh nhân mắc bệnh máu khó
đông nếu được phát hiện sớm, điều trị kịp thời và đầy đủ sẽ
tham gia sinh hoạt và hoạt động xã hội như những thành
viên bình thường.Trên cơ sở phương pháp này có thể áp
dụng để xác định sớm, xác định những cá thể mang gen
bệnh (người mẹ) cũng như các cá thể mang các đột biến tự
phát sinh có khả năng lan truyền trong quần thể đối với
bệnh máu khó đông hemophilia A. Qua đó cung cấp những
thông tin chính xác cho công tác chăm sóc và điều trị bệnh
nhân được tốt hơn. Đồng thời có thể đóng góp cho việc
điều tra chất lượng dân số và đề ra những chính sách thích
hợp.


CARRIER DETECTION OF HEMOPHILIA A BY
PCR-RFLP ANALYSIS OF THE Bcl 1 / INTRON 18
DNA POLYMORPHISMS

Le Nhat Minh
1
, Le Thi Kim Tuyen
1
, Vo Thi Thuong
Lan
2
, Đo Trung Phan
3

1
National Institute of Hygien and Epidemiology
2
Hanoi National University.
3
National Insitute of Hematology and Blood Transefer

The hemophilia are inherited, life-long,sex-linked disorders
occurring predominantly in males. The incidence is about
1: 5.000 male births and all races and socioeconomic
groups are affected. Haemophilia is allelic X linked
recesive disease caused by mutations in the human Factor
VIII gene. Haemophilia is the classical example of sex
linked recessive disorder. As males have only one X
chromosome, the synthesis of FVIII of FIX wil be deficient
if the relevant gene is defective. A commonly used strategy