SỬ DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG
NGHIÊN CỨU TƯƠNG TÁC PROTEIN

Dương Văn Hợp
Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà nội
Sokolenko, R.G.Hermann
Viện CNSH Thực vật. Đại học Tổng hợp Munich.Đức.
I. GIỚI THIỆU:

Nghiên cứu tương tác protein có ý nghĩa quan trọng
nhằm xác định chức năng và sự tham gia của chúng vào
một hay nhiều hoạt động sống cụ thể như quá trình phân
chia tế bào, sao chép DNA, tổng hợp protein hay vận
chuyển tín hiệu. Trên thực tế có nhiều phương pháp khác
nhau dùng cho nghiên cứu tương tác protein như; sắc kí ái
lực (Affinity chromatography), kết tủa miễn dịch (
Immunopricipitate) , tạo liên kết chéo ( Cross-linking).
Phương pháp sắc ký ái lực được thực hiện như sau:protein
nghiên cứu được cố định trên một chất mang ( ví dụ:
agarose, Sephadex). Sau đó mẫu chứa protein tương tác
được cho đi qua cột và chúng bị giữ lại. các protein bám
này được tách ra khỏi cột bằng các dung dịch thích hợp như
: SDS, muối NaCl, dung môi hữu cơ. người ta đã sử dụng
phương pháp này để tách các protein tương tác với RNAaza
từ 25 năm trước đây. (1).

Phương pháp kết tủa miễn dịch dựa vào phản ứng kháng
nguyên với kháng thể. ở đây người ta dùng chất mang
(Sepharose) gắn với protein A tương tác với kháng thể để
kết tủa phức hệ kháng nguyên kháng thể đồng thời kéo theo
các protein khác tương tác với protein nghiên cứu (kháng

protein) AD-X và BD-Y. Nếu hai protein X và Y có tương
tác với nhau thì cả AD và BD cùng hoạt hoá promotor và
sản phẩm của gen “báo cáo” được phát hiện. Ngược lại ,
nếu hai protein X và Y không tương tác với nhau thì tác
động của chúng đối với promotor là riêng rẽ do đó không
có sản phẩm của gen “báo cáo”.

Hình 1: Cơ sở phân tử của hệ thống lai kép

a. Phức hệ phiên mã gồm AD và BD
b. Sử dụng phức hệ phiên mã để nghiên cứu tương tác
hai protein X và Y

Phương pháp lai kép được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu
tương tác protein trong một số trường hợp sau:
1. Nghiên cứu tương tác hai protein như đã mô tả ở trên.
2. Nghiên cứu tương tác giữa các đoạn peptit chức năng
(domain) khác nhau của một protein với các protein khác.
3. Nghiên cứu sàng lọc (screening) từ thư viện gen để
tìm kiếm các protein tương tác với một protein đã biết.
Dưới đây chúng tôi sẽ trình bày một thí nghiệm ứng dụng
kỹ thuật hệ thống lai kép với tế bào chủ là nấm men để
nghiên cứu các protein tương tác vớ photphataza (TTP30).
II. SỬ DỤNG HỆ THỐNG LAI KÉP NGHIÊN CỨU
CÁC PROTEIN TƯƠNG TÁC VỚI MỘT
PHOTPHATAZA TTP30.

A.Vật liệu và dòng tế bào dùng cho nghiên cứu:

Thư viện gen (cDNA library) của Arabidopsis, Viện CNSH


B: Kết quả nghiên cứu:

1. Thu nhận dòng gen mã hoá cho TTP30 bằng kỹ
thuật PCR.

Gen TTP30 đã được nghiên cứu tại Việnn CNSH thực vật,
ĐHTH Munich. Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm của
gen là protein có hai nhóm chức năng phân biệt là vị trí
bám vào photphat : PB(435 bps ) và vị trí có độ lặp lại cao
của 4 a xitamin TPR( 550bps ). Với mục đích tìm hiểu các
protein tương tác với gen TTP30 cũng như với từng đoạn
peptit PB và TPR chúng tôi dùng phản ứng PCR để thu
được các đoạn gen mong muốn.

Khi dùng cặp mồi F1 và R1, chúng tôi nhận được gen đầy
đủ chứa cả hai vị trí PB và TPR(1050bps) và khi dùng các
cặp mồi F2, R2 và F3 ,R1 sẽ thu được các phần gen riêng
biệt cho PB và TPR. Kết quả điện di sản phẩm PCR được
trình bày ở hình2.

Hình 2: Sản phẩm PCR của gen TTP30 và các đoạn
PB,TPR. 2. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ pGBT9 và biến nạp
vào dòng tế bào nấm men HF7C.

Các đoạn mồi đều mong vị trí cắt của enzim giới hạn SmaI.
Chúng tôi đã tiến hành cắt riêng rẽ các sản phẩm PCR và

biến nạp nào với 2 dòng tế bào còn lại (PB và TPR). Để
khẳng định các thể biến nạp thu được chúng tôi đã xác định
hoạt độ betagalactosidaza và chỉ có hai thể biến nạp có hoạt
tính. Đồng thời chúng tôi đã dùng phản ứng PCR để phát
hiện đoạn gen cDNA khi dùng primer của plasmit
pGAD424 kết quả được trình bày ở hình 5.

Sơ đồ 1: Biến nạp plasmit pGAD424 gắn với cDNA vào
dòng nấm men HF7C mang pGBT9 có chứa
TTP30,PB,TPR. Hình 5: Kết quả xác định hoạt độ betagalactosidaza (a) và
phản ứng PCR của hai thể biến nạp thu được NHẬN XÉT:

Như vậy, khi dùng kỹ thuật lai kép với tế bào chủ là nấm
men HF7C chúng tôi đã thu được 2 gen mã hoá cho protein
tương tác với TTP30 có kích thước khoảng 1,6 kb ( kết quả
PCR).Gen TTP30 có hai vùng chức năng PB và TPR nhưng
không có biểu hiện tương tác với một protein nào từ thư
viện gen cDNA , điều này có thể liên quan đến việc tách
dòng riêng rẽ các vùng chức năng sẽ ảnh hưởng đến cấu
hình không gian và làm thay đổi khả năng tương tác của
chúng. Việc xác định loại gen và vùng tương tác của hai
dòng gen thu được ở trên chỉ được thực hiện sau khi giải
trình tự gen và axitamin của protein tương ứng kết hợp với
kỹ thuật tạo đột biến điẻm trong các nghiên cứu tiếp theo.