ĐẶT VẤN ĐỀ
H. influenzae trước đây được gọi là trực khuẩn Pfeiffer hay trực khuẩn
cúm [8] và là thành viên của họ Pasteurellaceae. Tên của vi khuẩn này luôn
gắn liền với tính chất sinh học đặc trưng và yếu tố lịch sử nghiên cứu [35].
H. influenzae là loài vi khuẩn được nghiên cứu từ rất sớm và đánh giá
là nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ,
đặc biệt là viêm màng não. Trong đó, H. influenzae typ b (Hib) được biết
thường gây bệnh cho trẻ dưới 5 tuổi không được tiêm chủng vacxin. Bệnh do
Hib phần nhiều xảy ra ở trẻ từ 3 tháng đến 2 tuổi, còn với những trẻ lớn hơn
dường như ít xuất hiện và đặc biệt ít xảy ra với những đối tượng trên 5 tuổi
[19], [11], [16]. Theo một số nghiên cứu ở Mỹ và những nước phát triển, hơn
một nửa (>50%) số trường hợp mắc bệnh do Hib là viêm màng não (với triệu
chứng: sốt, đau đầu và cứng gáy). Phần còn lại xuất hiện với các bệnh khác
như: viờm mô tế bào, viêm khớp hoặc nhiễm khuẩn huyết… [24].
Tại Việt Nam theo Phan Lê Thanh Hương thì tỷ lệ gây ra các bệnh
nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ, đặc biệt là viêm màng nóo do Hib chiếm
50% trong tổng số nguyên nhân do vi khuẩn. Trong đó, lứa tuổi 6 tháng đầu
tiên chiếm tỷ lệ cao nhất là 43%; từ 7-12 tháng chiếm 30%; từ 13-18 tháng
chiếm 14%; từ 19-24 tháng tuổi chiếm tỷ lệ 7%; từ 25-30 tháng tuổi chiếm
3% và dưới 59 tháng tuổi chỉ chiếm 2% [1], [5], [7]. Ngoài ra, một nghiên
cứu tại Mỹ trước năm 1985 nhằm xác định tỷ lệ từng loại vi khuẩn thường
gây viêm màng não là: H. influenzae, N. meningitidis và S. pneumoniae theo
lứa tuổi đã cho thấy Hib vẫn là nguyên nhân hàng đầu ở trẻ em dưới 5 tuổi và
đặc biệt là ở trẻ dưới 2 tuổi [24].
Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi thực hiện chuyên đề: “Vai trò gây
bệnh viêm màng não mủ cho trẻ dưới 5 tuổi của Haemophilus influenzae
typ b và các phương pháp chẩn đoỏn phòng xét nghiệm” nhằm đưa ra
1
những thông tin cơ bản nhất về đặc điểm gây bệnh viêm màng não mủ của
Hib cho trẻ dưới 5 tuổi và các phương pháp phát hiện vi khuẩn này trong chẩn
đoán viêm màng não mủ tại phòng xét nghiệm được sử dụng hiện nay. Đõy là

đột ngột tiến triển trong vài giờ. Những dấu hiệu và triệu chứng của viêm
màng não do vi khuẩn này cũng giống hệt như triệu chứng và dấu hiệu gặp
trong viêm màng não mủ do các vi khuẩn gây bệnh khác.
Những dấu hiệu không đặc hiệu, bao gồm: sốt, ngủ gà, kích thích, chán
ăn, nôn, suy hô hấp và rối loạn tõm thần. Đối với trẻ lớn thường có nhức đầu,
cứng gáy, sợ ánh sáng. Các dấu hiệu Brudzinski, Kernig và cứng gáy đặc
3
trưng ít thấy ở trẻ dưới 15 tháng tuổi. Thêm vào đó, những dấu hiệu khu trú
có thể xuất hiện sớm, có đến 1/3 số bệnh nhõn bị co giật trước khi nhập viện.
Tỷ lệ tử vong bởi viêm màng não do H. influenzae typ b khoảng 5% và
tỷ lệ mắc bệnh kéo dài là 15 – 30%.
1.3. Tỷ lệ Hib gõy bệnh viêm màng não mủ ở trẻ dưới 5 tuổi từ các nghiên
cứu trong và ngoài nước
H. influenzae typ b được xác định là căn nguyên phổ biến nhất gây các
bệnh nhiễm khuẩn ở trẻ em. Viêm màng não chiếm hơn 50% các bệnh nhiễm
trùng xâm hại do H. influenzae typ b, tiếp theo là viêm phổi (12 – 17%), viờm
mụ tế bào (6 – 15%) và nhiễm trùng huyết riêng lẻ (2 – 11%). Viêm xương
tủy, viêm khớp, viêm màng ngoài tim xảy ra ít phổ biến. Người lớn khỏe
mạnh ít mắc bệnh xâm hại do Hib [9].
Hầu hết tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao do H. influenzae typ b trên
toàn thế giới xảy ra ở trẻ dưới 5 tuổi. Vai trò của Hib trong gây viêm màng
4
Hình 1.1: Phân bố các vị trí nhiễm trùng bởi Hib và Hi không có vỏ ở
một số cơ quan [35].

Viêm màng não (Hib)
Viêm tai giữa (Hi không có vỏ)
Viêm xoang (Hi không có vỏ)
Viêm nắp thanh quản (Hib)
Viêm khí quản (Hi không có vỏ)

tại Viện Nhi Trung Ương từ tháng 12 năm 1998 đến tháng 12 năm 1999, cho
5
thấy kết quả về căn nguyên gây viêm màng não được xác định ở trẻ em nói
chung theo thứ tự hay gặp là: H. influenzae (50%), S. pneumoniae (22,06%),
N. meningitidis (11,76%), Streptococcus (5,88%), Klebsiella (4,22%), E.
coli, Staphylococcus, P. aeruginosa và Serratia spp (47%) cho dù chưa có
điều kiện xác định chi tiết về typ huyết thanh của mỗi loại vi khuẩn.
Như vậy, H. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis là căn nguyên
gây viờm màng não mủ hay gặp nhất ở trẻ em (83,82%). Trong đó, hàng đầu
là H. influenzae (50%).
Gần đõy, một số nghiên cứu khác của Phan Lê Thanh Hương, Đặng
Đức Anh cùng cộng sự về vai trò gây viêm màng não mủ của Hib ở trẻ dưới 5
tuổi tại Hà Nội và một số tỉnh phía Bắc từ 2000 - 2002 cũng đã cho thấy Hib
vẫn đứng đầu trong những căn nguyờn gõy viêm màng não mủ cho trẻ dưới 5
tuổi do vi khuẩn, chiếm 48,8%[1], [5].
- Những nghiên cứu ở nước ngoài:
Tại các nước châu Á, theo nghiên cứu ở nhiều nước của Peltola H năm
1999 cũng cho thấy được Hib là căn nguyên hàng đầu gây ra viờm màng não,
cụ thể, Hib chiếm 34%, S. pneumoniae chiếm 23%, N. meningitidis chiếm
14%, Salmonella chiếm 4% và 25% do các loại vi khuẩn khác. Ngoài ra,
nghiờn cứu của Yang Y tại Hefei - Trung Quốc cũng cho thấy được viờm
màng não do Hib chiếm 51,7%; N. meningitidis (Nm) là 38,3%, và S.
pneumoniae (Sp) là 8,3% [41], [57]; tại Đài Loan Hib cũng chiếm 42% tỷ lệ
căn nguyên gây viờm màng não [33], [37].
Những nước khỏc trên thế giới, hầu hếu các nghiên cứu đều cho thấy
Hib là căn nguyên chủ yếu gây viờm màng não. Điển hình như nghiên cứu ở
Mỹ năm 1990 cho thấy 3 vi khuẩn hàng đầu gây viêm màng não mủ cho trẻ
dưới 5 tuổi là: Hib, S. pneumoniae, N. meningitidis lần lượt chiếm tỷ lệ là
45%, 18% và 14% [39]; tại Oman năm 2008 vi khuẩn Hib, S. pneumoniae, N.
6

Biểu đồ 1.1: Tỷ lệ viêm màng não theo từng lứa tuổi do nguyên nhân
H. influenzae, N. meningitidis và S. pneumoniae trước năm 1985 tại Mỹ [35].
1.3.3. Phân bố tỷ lệ viêm màng não do Hib theo các nhóm tuổi:
- Những nghiên cứu ở trong nước:
Theo Phan Lê Thanh Hương, tất cả các trường hợp viêm màng não mủ
do Hib tập trung ở lứa tuổi từ 1 – 23 tháng (88%) [5], [7], [42].
- Những nghiên cứu ở nước ngoài:
Qua nghiên cứu tổng thể về tỷ lệ viêm màng não do Hib tại nhiều nước
trên thế giới, nhỡn chung viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi có sự phân
bố khác nhau trong từng nhóm tuổi, như sau: 1-5 tháng chiếm 22,6%; 6-11
tháng chiếm 35,6%; 12-23 tháng chiếm 23,8%. Tuy nhiên, qua thống kê từ
các nghiên cứu đều cho thấy ở lứa tuổi từ 0-11 tháng là có tỷ lệ viêm màng
não do Hib cao nhất [56]. Cụ thể, một điều tra tiến cứu được thực hiện từ năm
1997-1999 tại Ấn Độ để đánh giá tỷ lệ mắc viêm màng não do Hib, cho thấy:
ở lứa tuổi từ 0 – 4 là 15,9/100.000 (trong đó, ở lứa tuổi từ 24 – 59 tháng là
8
Tuổi (Tháng)
Số bệnh nhân trên 100.000 dân
7,1/100.000; ở lứa tuổi từ 0 – 11 tháng là 32/100.000 và ở lứa tuổi từ 12 – 23
tháng là 19/100.000) [34].
1.3.4. Tỷ lệ tử vong do viêm màng não bởi căn nguyên Hib ở trẻ dưới 5 tuổi:
Tại Việt Nam, tác giả Phan Lê Thanh Hương cho thấy tỷ lệ tử vong của
viêm màng não do Hib là 3% và các di chứng nặng do Hib (như: điếc-nghễnh
ngóng, mự-giảm thị lực, chậm phát triển tâm thần, động kinh, não úng thủy và
trạng thái thực vật) chiếm 13% [5]. Điều này cho thấy gánh nặng bệnh tật do
Hib gây ra rất lớn không những cho gia đình bệnh nhân mà còn cho toàn xã
hội.
Trên thế giới, một điều tra phân tích kết quả của 229 nghiên cứu về
VMN do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi, cho thấy tỷ lệ tử vong trung bình là 13,8%
(với trung vị 10% và dao động trong khoảng 0,0 – 65%). Trong đó, tỷ lệ chết

chúng không có tác dụng bảo vệ trong bệnh cảnh lâm sàng [10].
1.4.2. Vai trò của vacxin phòng Hib trong phòng bệnh viêm màng não mủ
cho trẻ dưới 5 tuổi do Hib
Vacxin phòng Hib được triển khai lần đầu tiên vào cuối năm 1985
nhằm để giải quyết 3 mối quan tâm chính, đó là: tỷ lệ tử vong cao bởi các
bệnh nhiễm trùng do Hib gây ra, di chứng nặng nề ở những trẻ viêm màng
não mủ do Hib xảy ra với tỷ lệ cao và sự gia tăng đề kháng của vi khuẩn này
với các kháng sinh thông dụng. Kháng thể kháng PRP trong huyết thanh được
biết là yếu tố căn bản để bảo vệ cơ thể trước nguy cơ tấn công của Hib. Vì
vậy, các nỗ lực đã được thực hiện để tăng nồng độ kháng thể trong máu bằng
cách sử dụng vacxin sản xuất từ vỏ polysaccharide tinh chế. Trong khi vacxin
PRP có hiệu quả trong bảo vệ trẻ từ 18 tháng tuổi trở lên chống lại các bệnh
10
nhiễm trùng xâm hại do Hib (hiệu quả ước tính đạt 90%), nhưng không có tác
dụng bảo vệ với lứa tuổi bé hơn, đõy là lứa tuổi có tỷ lệ mắc bệnh do Hib cao
nhất [38].
Biểu đồ 1.2: Tỷ lệ viêm màng não (VMN) giảm dần tại một số nước
Chõu Âu, sau khi sử dụng vacxin phòng Hib (theo: European Union-IBIS)
Chú thích: - Phần Lan (Finland)
- Hà Lan (Netherlands)
- Anh (UK)
- Ai Len (Ireland)
- It – xa - en (Israel)
Hiện tượng vacxin PRP không có khả năng bảo vệ cho trẻ ở lứa tuổi
nhỏ hơn đối với Hib được giải thích do cấu trúc hóa học vỏ polysaccharide
của Hib. PRP, một dạng trùng hợp của các đường pentose, không kích thích
11
Mức độ giảm tỷ lệ VMN do Hib
Giai
đoạn

hành tiêm chủng mở rộng vacxin phòng Hib (biểu đồ 1.2).
Có 4 loại vacxin phòng Hib đã trải qua đỏnh giỏ trờn lâm sàng: PRP-D
(Connaught Laboratories), PRP-T (Pasteur – Meriéux), PRP-OMPC (Merck
12
Sharp and Dohme) và HbOC (Praxis Biologicals). Mỗi loại vacxin này có sự
khác nhau về một hay vài đặc điểm như: loại phân tử protein cộng hợp với
kháng nguyên polysaccharide, kích thước của bán kháng nguyên
polysaccharide, loại liên kết giữa kháng nguyên với protein cộng hợp và tỷ lệ
của polysaccharide với protein. Những khác biệt về hóa lý như vậy đều có
ảnh hưởng đến khả năng kích thích miễn dịch của từng loại vacxin. Thêm vào
đó, sự khác nhau về liều vacxin và khoảng cách giữa các liều cũng ảnh hưởng
đến đáp ứng miễn dịch hay khả năng bảo vệ của cơ thể.
Nồng độ kháng thể trong huyết thanh được sinh ra do vacxin cần thiết
để chống lại Hib chưa được biết chính xác. Đõy là vấn đề đưa ra rất phức tạp
khi với một nồng độ kháng thể tương đương vẫn có thể có hoạt động chức
năng khác nhau [20]. Sự duy trì nồng độ ngưỡng của kháng thể kháng PRP
trong huyết thanh có thể không cần thiết nếu những đứa trẻ được gây miễn
dịch đáp ứng có hiệu quả khi phơi nhiễm với Hib.
Những nghiên cứu về hiệu lực của vacxin cho thấy PRP-D, PRP-T,
PRP-OMPC và HbOC có thể ngăn chặn được hơn 90% các bệnh nhiễm trùng
do Hib [12], [13], [48]. Tuy nhiên, PRP-D được chứng minh là không có hiệu
quả trong thử nghiệm về hiệu lực ở trẻ em vùng Alaska [52]. Vì vậy, sự lựa
chọn giữa vacxin không phù hợp có thể bị chỉ trích ở những vựng dõn cư, ở
đú có áp lực về bệnh nhiễm trùng rất cao và tỷ lệ mắc bệnh nhiều nhất gặp ở
lứa tuổi thấp. Tại những quần thể này, vacxin cộng hợp có khả năng kích
thích miễn dịch mạnh ngay liều đầu tiên là lựa chọn tốt nhất [10]. Cho nên,
những đứa trẻ nhỏ nhất với nguy cơ mắc Hib cao nhất sẽ có cơ hội sớm nhất
đạt được miễn dịch đủ khả năng bảo vệ cơ thể. Ngoài ra, trong hầu hết các
quần thể dân cư, sự lựa chọn vacxin còn phải dựa trên các yếu tố khác, đặc
biệt quan trọng nhất là giá cả.

Cao Văn Viên [3] với 1.134 chủng Hi phân lập được cho thấy vi khuẩn này đề
kháng cao nhất với co-trimoxazole (54,2%), tiếp đó với ampicillin (44,9%),
gentamicin (11,6%) và chloramphenicol (8,1%), trong đó ceftriaxone bị đề
kháng thấp nhất (1,4%). Tỷ lệ các chủng Hi có khả năng sản xuất enzym
Chloramphenicol-Acetyl-Transferase tăng lên theo thời gian, đây là khuynh
hướng có liên quan đến khả năng đề kháng kháng sinh chloramphenicol
(p<0,01) [3]. Một nghiên cứu khác của Lê Huy Chính, Nguyễn Văn Trọng và
cộng sự năm 2007 [4] về tỷ lệ mang Haemophilus influenzae, Streptococcus
pneumoniae ở trẻ em dưới 60 tháng tuổi trong cộng đồng một số tỉnh Miền
Bắc Việt Nam và mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập
được, cũng cho thấy vi khuẩn này đề kháng cao nhất với co-trimoxazole
(69,6%), tiếp đó với chloramphenicol (16,4%), amoxillin (5,6%); những
kháng sinh còn nhạy cảm cao (trên 98,5%) là ceftriaxone/ co-amoxiclav/
levofloxacin bị đề kháng thấp nhất (khoảng 1,0%). Ngoài ra, có 13,3% các
chủng đa kháng với co-trimoxazole và chloramphenicol; 1% các chủng đa
kháng với co-trimoxazole, chloramphenicol và amoxillin. Tuy nhiên, những
nghiên cứu trước đây đều chỉ thực hiện với các chủng Hi. Vì vậy, một nghiên
cứu về đặc điểm kiểu gen, kiểu hình của các chủng Hib phân lập từ trẻ viêm
màng não mủ và các thành viên trong gia đình năm 2006 của Phan Lê Thanh
Hương và cộng sự [7][43], đã cho thấy những kháng sinh ceftriaxon, cefaclor,
cefotaxim, cefpodoxim, meropenem, levofloxacin, rifampicin vẫn có hiệu quả
trong điều trị Hib với mức độ nhạy cảm gần 100%; thêm vào đó những chủng
Hib phân lập được cũng đề kháng với nhiều loại kháng sinh, cụ thể: tỷ lệ Hib
có khả năng sản xuất enzym β-lactamase chiếm 59,7%; khả năng đề kháng
với ampicillin (40,3%); với chloramphenicol 46,5%; ngoài ra, nghiên cứu này
cũng cho thấy khả năng đề kháng với kháng sinh ampicillin, chloramphenicol
15
và sulbactam/ampicillin của Hib có liên quan đến khả năng sinh enzym β-
lactamase. Vì vậy, gen đề kháng kháng sinh chloramphenicol có thể nằm trên
cùng một đoạn gen có chứa gen quy định tổng hợp enzym β-lactamase [7].

với ampicillin, chloramphenicol và cotrimoxazole [32]. Thêm vào đó, nghiờn
cứu của Marina Cerquetti và cộng sự tại Ý về mức độ nhạy cảm với kháng
sinh của các chủng Hi phân lập được từ bệnh nhiễm trùng xõm hại cũng đưa
ra được tỷ lệ Hi đề kháng với ampicillin là 10,2%; chloramphenicol là 1,7%
[14].
Một số nghiên cứu gần đây tại châu Á, châu Âu, Mỹ, Canada cho thấy,
sulbactam/ampicilin, ceftriaxon, cefaclor, cefotaxim, cefpodoxim,
meropenem, levofloxacin, rifampicin, azithromycin, clarithromycin vẫn được
xem là những kháng sinh có độ nhạy cao (xấp xỉ 100%) đối với Hib [14],
[32], [47], [49]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Haghiashteiani MT và cộng sự tại
Iran cho thấy 19 chủng Hib phân lập được từ bệnh nhi viêm màng não mủ có
khả năng đề kháng cao với những loại kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin,
cụ thể 47% với cephalotin và 42% với ceftriaxon, ceftazidim, cefixim,
ceftizoxim, nhưng số chủng Hib đưa ra nghiên cứu cũn quỏ thấp (19 chủng)
nên tỷ lệ đưa ra có thể chưa chính xác.
17
Chương II
MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÁT HIỆN HAEMOPHILUS
INFLUENZAE TYP B TRONG CHẨN ĐOÁN
VIÊM MÀNG NÃO MỦ TẠI PHềNG XÉT NGHIỆM
Hi là loại vi khuẩn khó nuôi cấy. Hi chỉ mọc trên môi trường giàu chất
dinh dưỡng có chứa đầy đủ hai yếu tố phát triển X (hemin), V (NAD hoặc
NADP) và không có khả năng mọc trờn cỏc môi trường thông thường. Vì
vậy, việc chẩn đoán viêm màng não do Hib chủ yếu được thực hiện ở bệnh
viện lớn và phương pháp nuôi cấy phân lập thường được áp dụng nhất ở Việt
Nam nên khả năng phát hiện căn nguyên vi khuẩn Hib rất thấp (khoảng 10%)
[6].
Hiện nay, ngoài phương pháp nuôi cấy phân lập truyền thống, những
phương pháp chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao được áp dụng để phát
hiện Hib trong chẩn đoán viêm màng nóo. Tuy nhiờn, các phương pháp hiện

o
để làm
sạch bề mặt da và loại bỏ chất bã nhờn. Sau đó sát khuẩn tiếp bằng cồn Iod
hoặc povidone-iodine. Để khô.
19
/ Đeo găng tay vô trùng.
/ Xác định vùng giữa đốt sống thắt lưng L3–L4.
Hình 2.2: Vị trí chọc hút bệnh phẩm DNT
/ Chọc kim hướng vào giữa hai mỏm gai xuyên qua dây chằng vào
khoảng (kênh) chứa DNT, lấy ít nhất 1ml và nhiều nhất là 3- 4ml (nếu có thể)
và cho vào ống nghiệm sạch vô trùng có nắp đạy.
Hình 2.3: Cách chọc kim tiêm để lấy bệnh phẩm DNT
- Vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm
Ngay sau khi được lấy, bệnh phẩm nên được đưa ngay đến phòng xét
nghiệm vi sinh để tiến hành các kỹ thuật chẩn đoán càng sớm càng tốt (trong
vòng 1 giờ sau khi lấy bệnh phẩm). Không được để DNT bị ánh sáng trực tiếp
chiếu vào hoặc để nhiệt độ quỏ núng hay quá lạnh. Nếu bệnh phẩm không thể
vận chuyển sớm về phòng xét nghiệm thì có thể bơm bệnh phẩm DNT vào
môi trường T-I (Trans-Isolate medium) và để qua đêm ở nhiệt độ 35
o
C. T-I là
môi trường hai pha, rất thuận tiện cho nuôi cấy nguyên thủy N. meningitidis
20
và các loại vi khuẩn gây bệnh khác có trong bệnh phẩm DNT hay bệnh phẩm
máu.
Hình 2.4: Môi trường vận chuyển T-I (Trans-Isolate medium) [15]
2.1.1.2. Nhuộm gram bệnh phẩm DNT
Một phương pháp chẩn đoán sơ bộ Hib cũng như các vi khuẩn khỏc
gõy VMN có thể thực hiện bởi kỹ thuật nhuộm gram từ cặn dịch não tủy hoặc
bằng cách phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong DNT bởi kỹ thuật

C
5- 10% CO
2
Nước nổi
Cặn
Ngưng kết
hạt latex
Nhuộm
Gram
Cấy lên thạch
chocolate
Cấy lên thạch
chocolate
Sơ đồ 2.1: Quy trình xét nghiệm chẩn đoán bệnh phẩm dịch nóo tủy
[15]
Hình 2.5: Hình thể của H. influenzae typ b trên tiêu bản nhuộm gram
dịch não tuỷ dưới kính hiển vi quang học.
2.1.1.3. Nuôi cấy
Hình 2.6: Hình ảnh khuẩn lạc Streptococcus pneumoniae (1) và
Haemophilus influenzae typ b (2)
23
(1)
(2)
Lấy đầy một ăng cặn bệnh phẩm nuôi cấy vào môi trường thạch
chocolate có bổ sung IsoVitalex. Ủ ở 37
o
C với khí trường 5% CO
2
khoảng 18-
24 giờ.