23

Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -80
0
C khoảng 30 phút. Thấy DNA
kết tủa lơ lửng thành dạng sợi mảnh .
Ly tâm bỏ phần dung dịch bên trên.Thu lấy kết tủa chính là DNA.
Làm khô DNA bằng cách phơi DNA trong 2h ở nhiệt độ phòng và cho
vào TE.1X làm hòa tan DNA, trữ mẫu ở -4
0
C hoặc -20
0
C.
Điện di và đọc kết quả.
3.4.5 Quy trình Khuếch đại gen Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và
gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beaveria Bassiana vuille
3.4.5.1 Nấm Metarrhizium anisopliae
Đoạn DNA đƣợc khuếch đại theo phƣơng pháp PCR với cặp primer có
trình tự cụ thể nhƣ sau:
- METPR1: 5’CAC TCT TCT CCC AGC CGT TC 3’
- METPR4 : 5’GTA GCT CAA CTT CCG CAC TC 3’
(Nguồn : Leger St., 1992)
Bảng 3.1 Các thành phần trong phản ứng PCR trên nấm Metarrhizium
Thành phần Nồng độ cuối Thực hút (µl)
- PCR buffer 1X 2.5µl
- MgCl
2
1.5mM 0.75µl
- dNTP 200mM mỗi dNTP 0.5µl
- METPR1 50ng 1.5µl
- METPR4 50ng 1.5µl

- Kéo dài 72
0
C 6 phút
- Ủ 4
0
C 6 phút

3.4.5.2 Nấm Baeuveria Bassiana vuille
Đọan DNA đƣợc khuếch đại có trình tự primer cụ thể nhƣ sau :
Primer Trình tự (5’-3’)
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

Bảng 3.3 Các thành phần trong phản ứng PCR trên nấm Beauveria
Thành phần Nồng độ cuối Thực hút (µl)

- PCR buffer 1X 2.5µl
- MgCl
2
1.5mM 0.75µl
- dNTP 200mM mỗi dNTP 0.5µl
- ITS 4 50ng 1µl
- ITS 5 50ng 1µl
- Tag DNA polymerase 1UI 0.25µl
- DNA khuôn 100ng 1µl
- Nƣớc cất 2 lần vô trùng vừa đủ 25 l

25
- Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ gel), chú ý
tránh bọt khí trên gel.
- Để nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, cẩn thận rút lƣợc ra khỏi
gel, cho dung dịch 0.5X TAE vào bể điện di sao cho bảo đảm ngập
gel.
- Trộn 5 l sản phẩm PCR với 2 l loading dye 6X trên mặt giấy
paraffin. Cho hỗn hợp vào các giếng của gel: gồm có giếng than
chuẩn, giếng đối chứng và các giếng chứa các mẫu cần xác định kiểu
gen, vận hành máy điện di trong 30 phút ở 100V và 250mA
3.4.6.2 Đọc kết quả điện di
- Sau khi điện di ngâm gel trong hỗn hợp ethidium bromide 1 l/ml và
TAE 0,5X trong 15 phút.
26

- Rửa lại bằng nƣớc nhiều lần và đặt vào máy chụp gel hiệu Bio-Rad
(phần mềm quantity one 2000).
- Ethidium bromide liên kết với DNA sẽ phát sáng dƣới tia UV, kết
quả sẽ xuất hiện những băng sáng trên gel.
- Xác định kết quả dự kiến: đối với cặp primer METPR1/METPR4 thì
trên màn hình xuất hiện băng có kích thƣớc 1,5kb.
3.4.7 Tiến hành giải trình tự gen gây độc Pr1 trên nấm Metarrhizium
anisopliae và ITS1 – 5.8s – ITS2 trên nấm Beaveria Bassiana vuille
Sau khi chạy PCR chúng tôi tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR vừa
khuếch đại để xác định chính xác đây là đoạn gen gây độc Pr1 và vùng
ITS1 – 5.8S – ITS2 nhằm xác định trình tự nucleotide của đoạn gen độc
này, từ đó so sánh với ngân hàng gen thế giới.
Đầu tiên để đạt đƣợc kết quả cao nên phải tiến hành tinh sạch sản
phẩm PCR để việc đọc trình tự đạt kết quả cao.
3.4.7.1 Tinh sạch sản phẩm PCR
1.Lấy GFX cho vào ống thu dịch lọc đã khử trùng sạch (số lƣợng GFX


Thành phần Nồng độ Thể tích(µl)

- BDT mix 2,5 X 4µl
- Buffer 5 X 2µl
- Primer 3.2 pmol 1µl
- DNA khuôn 10-40 ng 1µl
- Nƣớc cho đến 10 µl

* Quy trình nhiệt của phản ứng PCR trong đọc trình tự
* Nấm Metarrhizium anisopliae
1. Đặt tube vào máy PCR và chỉnh đến thể tích chính xác.
2. Biến tính hoàn toàn: 96
0
C trong 1 phút.
3. Lặp lại 25 chu kỳ: 96
0
C trong 10 giây.
50
0
C trong 5 giây.
60
0
C trong 4 phút.
4. Giữ ở 4
0
C.
* Nấm Beaveria Bassiana vuille
1. Đặt tube vào máy và chỉnh đúng các thông số.
2. Biến tính hoàn toàn: 95

C
trong 3 phút.
3.4.9 chạy điện di và ghi nhận tính hiệu trên máy sequencer ABI PRISM
3100
sản phẩm sau tinh sạch, tiến hành điện di và đọc kết quả trên máy
Sequencer.
3.4.10 Phân tích RFLP
*Quy trình chung phản ứng cắt
- Ủ khoảng 1 g DNA đã đƣợc khuếch đại với 1U enzyme cắt dƣới những
điều kiện nhà sản xuất (Roche) hƣớng dẫn. Thành phần của phản ứng
xem bảng 3.6.
- Những đoạn DNA đã cắt đƣợc phân tách bằng điện di trên gel agarose
2%, sau đó gel đƣợc nhuộm ethidium brommide. Đọc kết quả và
chụp hình dƣới tia UV.
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng enzyme cắt
Thành phần phản ứng
Nồng độ đầu
Thể tích
SuRE/cut Buffer
DNA
Restriction enzyme
Nƣớc cất vô trùng
10X
100 – 150 ng
10 UI

2,5 l
6 – 10 l
0,1 l
Vừa đủ thể tích 25 l


Hình 4.1 Nấm Metarrhizium anisopliae(A)
Nấm Beauveria bassiana (B)
A
B B
A
30 4.2 Kết quả ly trích DNA của các mẫu nấm Metarrhizium anisopliae và
Beauveria bassiana
Sau thu sinh khối chúng tôi tiến hành ly trích các dòng nấm, đây là một quá
trình đơn giản nhƣng có ý nghĩa quyết định đến chất lƣợng sản phẩm DNA thu đƣợc
trong những bƣớc tiếp theo, phải thao tác nhẹ nhàng và chính xác theo qui trình chung
nhằm tránh sự đứt gãy DNA, nhiễm tạp….Qua điện di cho thấy mẫu ly trích có lƣợng
DNA thu đƣợc chƣa nhiều, còn lẫn tạp và gãy DNA do quá trình thao tác chƣa tốt .
Sản phẩm DNA ly trích đƣợc điện di trên gel thƣờng có nồng độ gel1 %, hiệu
điện thế 50 v, 250 mA, trong khỏang thời gian 50 phút
Hình 4.3 Hình ảnh DNA tổng số của nấm
Beauveria và Metarrhizium sau khi xử lý RNAse
Ghi chú:1.RMTĐ3 7.SCLLLA1
2.BHBD6 8.DONG 3-1
3.NNRT7 9.BDQ96
4.SR 10.BDTN4
5.PULQ2 11.BXĐTG6
6.BRVT6 12.RNBT1.7
Sau tinh sạch ta thấy rằng các mẫu 1.RMTĐ3, 2.BHBD6, 4.SR, 5.PULQ2,
9.BDQ9 lƣợng DNA còn nhiều, khi tiến hành phản ứng PCR với những mẫu này cần
phải pha lõang nồng độ DNA trong nƣớc cất 2 lần khỏang từ 7-10 lần. Riêng những
mẫu còn lại gồm 3.NNPT7, 6.BRVT6, 7.SCLLLA1, 8.DONG3-1, 10.BDTN4
11.BXĐTG6, 12.RNBT1.7 do nồng độ DNA trong mẫu còn ít hơn nên có thể pha
lõang từ 1-3 lần hoặc không pha lõang. Vd:đối với mẫu 6.BRVT6.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
DNA toång soá
Tạp nhiễm
32 4.4. Kết quả phản ứng PCR
Thực hiện PCR trên 12 dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria
bassiana, tuy nhiên kết quả khuếch đại sản phẩm DNA chỉ thu đƣợc 6 dòng nấm
Beauveria bassiana khi sử dụng cặp mồi ITS4 và ITS5. qua hình 4.4 chúng tôi đã
khuếch đại đƣợc vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 gây độc cao, mặc dù đƣợc phân lập từ
nhiều ký chủ và địa phƣơng khác nhau nhƣng vẫn cho kích thƣớt các band trên gel
nhƣ nhau.
Phản ứng PCR chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nồng độ DNA, nhiệt độ

Ghi chú :1. RMTĐ3
2.SR
3.BHBD6
4.BRVT6
5.PULQ2
6.NNPT7
7.LADDER
4.5. Kết quả phân tích RFLP trên các dòng nấm Beauveria bassiana vuille
Khi thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn cho 6 dòng nấm Beauveria
Bassiana. kết quả cho thấy chƣa thấy rõ sự đa dạng về di truyền giữa các dòng nấm,
nguyên nhân là do không có khả năng khảo sát trên nhiều enzyme cắt khác nhau, mà
chỉ thực hiện đƣợc phản ứng cắt trên 2 enzyme đặc trƣng Hae III và Alu I. Vì thế nên
chƣa thấy rõ đƣợc sự đa hình trên các band địên di, chỉ cho 2 band có kích thƣớc nhƣ
nhau trên cả 6 dòng phân tích. Tuy nhiên tổng kích thƣớc band trên mỗi mẫu đều
tƣơng đƣơng với kích thƣớc của ladder 580 bp
Với enzyme HaeIII khi cắt trên 6 dòng nấm Beauveria bassiana gồm 1.RMTĐ3,
2.SR, 3.BHBD6, 4.BRVT6, 5.PULQ2, 6.NNPT7, qua hình 4.5 cho thấy enzyme cắt đƣợc
hết sản phẩm PCR trên cả 6 mẫu nấm, tạo thành 2 band có kích thƣớc tƣơng đƣơng
trên ladder 1.5 kb là 200 bp và 380 bp. Nồng độ DNA là 100ng (sử dụng 6µl).
1 2 3 4 5 6 7
1 kb

580 bp
34

với enzyme Alu I cũng thực hiện phản ứng cắt trên 6 dòng Beauveria bassiana
nhƣ với enzyme Hae III. Qua hình 4.9 cho thấy enzyme Alu I cũngcắt đƣợc hết lƣợng
sản phẩm PCR của các mẫu nấm ban đầu, và tạo thành 2 band có kích thƣớc tƣơng
ứng trên ladder là 250 bp và 330 bp. Do quá trình bơm mẫu vào giếng và giai đọan
trộn mẫu thao tác chuẩn nên kích thƣớc các band chƣa đề. Tuy nhiên với kích thƣớc

Alu I
Hae III
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
35
Phần V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận
- Đã phục hồi đƣợc 12 nguồn nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria
bassiana trên các côn trùng khác nhau: bọ xít đen, bọ dừa, sâu cuốn lá lúa, rầy nâu ở
các tỉnh Tiền Giang, Tây Ninh, Long An, Bến Tre, Quận 9 – Thành phố Hồ Chí
Minh, Quận 2 – thành phố Hồ Chí Minh.
- Sử dụng kỹ thuật PCR đã cho phép phát hiện vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 ở nấm
Beauveria với cặp mồi ITS4 và ITS5, các thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt cụ thể
đã đƣợc hoàn thiện.
5.2. Đề nghị
- Tiếp tục thu thập, phục hồi và phân tích sự đa dạng di truyền của các dòng
nấm Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae với số lƣợng mẫu lớn hơn từ
nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc nhằm làm phong phú thêm bộ giống các chủng nấm
ký sinh côn trùng phân lập từ tự nhiên ở Việt Nam. Tạo điều kiện phục vụ dắc lực cho
Nông nghiệp nói chung và công tác bảo vệ thực vật nói riêng .
- Trong phân tích RFLP, sản phẩm cắt chƣa cho thấy rõ sự đa hình giữa các
dòng nấm với nhau. Nếu có điều kiện cần tiếp tục hoàn thiện và đọc trình tự trên nhiều
đối tƣợng khác nhau , từ đó so sánh với ngân hàng gen trên thế giới để biết sự khác
biệt và có hƣớng nghiên cứu phù hợp .
5. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000. Vi nấm dùng trong công nghệ
sinh học. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Trang 140 – 145.

6. Trần Quang Hùng, 1999. Thuốc bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản nông nghiệp.
Trang 150 – 155.

7. Nguyễn Thị Thƣ Hƣơng, 2004. Xác định gen gây độc của nấm
Metarrhizium ký sinh trên sâu hại cây trồng bằng kỹ thuật PCR. Luận án
thạc sĩ. Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Trang 7 –30.

8. Võ Thị Thƣơng Lan. Sinh học phân tử. Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Trang
159 – 161.

9. Lê Đình Lƣơng, 2001. Nguyên lý kỹ thuật di truyền. Nhà xuất bản khoa học
và kỹ thuật Hà Nội.

10. Trần Văn Mão, 2004. Sử dụng vi sinh vật có ích tập II. Nhà xuất bản nông
nghiệp Hà Nội. Trang 49 – 90.

11. Tống Kim Thuần, 2001. Vi sinh vật diệt sâu hại đậu tương và triển vọng sử
dụng chúng ở Đồng Bằng Sông Hồng. Tạp chí sinh học 9/2001, 23(3): 22 –
28.

12. Phạm Thị Thùy, Ngƣyễn Văn Thiêm, Võ Hiền, 2000. Kết quả khảo nghiệm
chế phẩm nấm Metarrhizium anisopliae để phòng trừ bọ hại dừa.
37 13. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997. Bảo vệ cây trồng
bằng các chế phẩm từ vi nấm. Nhà xuất bản nông nghiệp thành phố Hồ Chí


20. Fegan M., Manners J.M., Maclean D.J., Irwin J.A., Samuels K.D., and
Holdom D.P., 1993. Random amplified polymorphic DNA markers reveal a
high degree of genetic diversity in the entomopathogenic fungus
Metarrhizium anisoliae var anisopliae. Gene Microbiol 139 (Pt9): 2075 –
2081.

21. Hegedus D.D., and Khachatourians G.G., 1993. Construction of cloned
DNA probes for the specific detection of the entomopathogenic fungus
Beauveria bassiana in grasshoppers. Journal of Invertebrate Pathology 62:
233 –240.

22. Joshi L., Leger R.J.St., and Roberts D.W., 1997. Isolation of a cDNA
encoding a novel subtilisin – like protease (Pr1B) from the
38

enthomopathogenic fungus, Metarrhizium anisopliae using differential
display RT-PCR. Gene 197: 1 – 8.

23. Leal S.C.M., Bertioli D.J., Butt T.M., Carder J.H., Burrows P.R., and
Feberdy J.F., 1994. Characterization of isolates of the entomopathogenic
fungus Metarrhizium anisopliae by RAPD – PCR. Mycological Research
98: 1077 – 1081.

24. Leger R.S.T., Roberts D.W., and Staples R.C., 1999. Molecular cloning of
a comlimentary DNA sequence encoding a cuticle degrading protease
produced by entomopathogenic fungi. Boyce Thompson Institute for Plant
Research, Inc, Ithaca, NY.

25. Maria C.V., and Peberdy J.F., 1997. Location of chitinolytic enzymes in

32. Riba, G, Bouvier-Fuorcade, I.,and caudal, A. (1986) Isoenzyme
polymorphisms in Metarrhizium anisopliae (Deute-romycotina,
Hyphomycetes) entomogenous fungi . Mycopa-thologia 96,161-169
39 33. File://D:\Beauveria-
thang7\Selection%20of%20Beauveria%20bassiana%20and%20Metarh
8/17/2004

34. Kosir, J . M., MacPherson, J.M. &Khachatuorians, G. G.(1991). Genomic
analysis of c Virulent and a less virulent strain of the enthomopathogenic
fungus Beauveria bassiana , using restriction fragment length
polymorphism . Canadian Journal of Microbiology 37,534-541

35. Mugnai, L,. Bridge . P.D & Evans, H.C. (1989). A chemotaxonomic
evaluation of genus Beauveria . Mycological Research 92,199-209

36. poprawski, T. J., Riba, G., Jones, W. A. & Aioun , A. (1988) . Variation in
isoesterase profiles of geographic population of Beauveria bassiana
(Dueteromycotina: Hypomycetes ) isolates from Sitona weevils
(Coleoptera:curculiondae). Environmental Entomology 17 , 275-279