1
Phần I. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật trong nông nghiệp đã mang lại nhiều thành
tựu to lớn trong đó quan trọng nhất là giảm tỷ lệ đói nghèo trên thế giới nhờ nâng cao
năng suất cây trồng. Mặc dù thuốc bảo vệ thực vật giúp giảm tổn thất do sâu hại (ước
tính mức độ tổn thất do sâu hại nếu không sử dụng thuốc trừ sâu là 83 % ở lúa gạo và
84 % ở bông vải (Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long, 2004)) song thuốc trừ sâu cũng
mang lại những bất lợi khó giải quyết như: ô nhiễm môi trường, độc hại cho sức khỏe
con người, mất cân bằng sinh thái và gây tính kháng của côn trùng. Trong những năm
gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các nhà khoa học tập
trung nghiên cứu tạo ra các cây trồng chuyển gen mang tính kháng, xem các giống
kháng là thành phần chủ yếu trong hệ thống phòng trừ tổng hợp. Tuy nhiên, những gen
dùng trong công nghệ chuyển gen còn ít, chuyển gen tỷ lệ thành công thấp và vẫn còn
tồn tại những tranh cãi về tính an toàn của cây chuyển gen nên thuốc trừ sâu vi sinh
được coi là giải pháp khả thi, có thể đáp ứng nhanh yêu cầu của con người về một giải
pháp phòng trừ sâu hại an toàn môi sinh và hiệu quả, giúp hạn chế sử dụng thuốc trừ
sâu hóa học. Thuốc trừ sâu vi sinh gồm các sản phẩm từ các loài thiên địch của sâu
như: các loài ăn mồi, ký sinh, nguồn bệnh, trong đó các chế phẩm tạo nên trên cơ sở
các loài nấm chiếm vị trí quan trọng, đặc biệt chế phẩm nấm diệt sâu từ nấm
Beauveria bassiana đã có hiệu lực cao tiêu diệt nhiều loài côn trùng gây hại. Để nâng
cao hiệu quả ứng dụng của nấm này, cần đẩy mạnh các nghiên cứu về sinh học, sinh
lý, sinh thái và mối quan hệ giữa nấm Beauveria bassiana với côn trùng vật chủ.
Trong đó, nhiệm vụ trung tâm của công nghệ sinh học hiện nay khi nghiên cứu các đối
tượng là đọc được chuỗi mã DNA để phân tích bộ genome nhằm tìm hiểu quan hệ di
truyền của các đối tượng nghiên cứu và mối liên hệ giữa genome với tính độc của nấm
nhằm tạo ra các chế phẩm vi nấm có hiệu quả diệt côn trùng cao. Trong phạm vi
nghiên cứu của đề tài, chúng tôi chỉ đọc trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của rDNA
để so sánh sự biến đổi trong trình tự giữa các chủng nấm Beauveria bassiana. 3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana
2.1.1. Vị trí phân loại
Lớp: Deuteromycetes.
Bộ: Moniliales.
Họ: Moniliaceae.
Giống: Beauveria.
Giống Beauveria thường được chia thành 3 loài: Beauveria bassiana,
Beauveria brongniarti, Beauveria alba, trong đó 2 loài đầu là tác nhân gây bệnh côn
trùng (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).

2.1.2. Đặc điểm hình thái
Theo Nguyễn Ngọc Tú - Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), “Nấm
Beauveria bassiana có bào tử trần hình cầu (đường kính 1 - 4 m) đến hình trứng (1,5-
5,5 x 1,3 m). Sợi nấm có chiều ngang khoảng 3 - 5 m phát triển dày đặt trên môi
trường, mang nhiều cuống sinh bào tử và bào tử. Mặt khuẩn lạc nấm dạng phấn trắng.”
Nấm khi mọc trên côn trùng thường có màu trắng hoặc vàng nhạt, đôi khi hơi sẫm, bề
mặt trơn và có nhiều bột, hiếm khi tập hợp thành bó sợi.
Khi mọc trên môi trường thạch, nấm Beauveria bassiana nhìn chung có màu
trắng, viền khuẩn lạc thường có màu kem hoặc vàng nhạt, thỉnh thoảng có màu đỏ nhạt
(Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).
Beauveria bassiana tạo rất nhiều bào tử, bào tử thường có hình cầu, hình trứng,
có khi chiều dài lên tới 20 m với 1 m chiều rộng. Các sợi nấm khí sinh mang các giá
bào tử trần ngắn, phồng to 3 - 5 x 3 - 6 m. Các giá bào tử này hoặc tạo thành các

phát triển tạo sinh khối của nấm Beauveria bassiana và theo Goral (1970) nấm
Beauveria bassiana thuộc vi sinh vật có khả năng điều chỉnh pH môi trường, pH thuận
lợi cho sự phát triển là 5,7 - 6,0. Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu cho rằng khả năng phát
triển tốt nhất của nấm Beauveria bassiana là 6,2 - 6,3 (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú
và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).

2.1.4. Điều kiện phân bố
Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng khắp. Giống như hầu hết các loại nấm
diệt sâu khác, khi rơi vào một nơi nào đó, chúng đều có khả năng trở thành thành viên
trong sinh quần nơi đó và tự sinh sôi nảy nở tăng lên. Vì là vật ký sinh chuyên hóa

5
rộng nên nấm này có khả năng tồn tại khi thiếu vật chủ chính. Khả năng nhiễm thành
công của nấm với côn trùng là khá lớn vì chúng có nhiều cách xâm nhiễm khác nhau:
qua lớp cutin, qua đường tiêu hóa, qua đường hô hấp và qua lỗ của thân. Ngoài ra, nấm
Beauveria bassiana còn có khả năng tồn tại trong điều kiện môi trường không thuận
lợi dưới dạng giả hạch nấm (các sợi nấm dinh dưỡng kết lại thành một thể rắn chắc).
Có thể sử dụng rộng rãi nấm Beauveria bassiana trong thực tiễn nông nghiệp vì:
chúng có thể phát triển trên môi trường dinh dưỡng, có thể được chế tạo ở dạng chế
phẩm sinh học, và tiêu diệt một lượng không nhiều các côn trùng có ích (Nguyễn Ngọc
Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).
Nấm Beauveria bassiana có khả năng phát tán rộng trong thiên nhiên thông qua
các hoạt động phóng bào tử bằng cơ học (chúng có có khả năng bắn bào tử tới khoảng
cách gấp hàng nghìn lần lớn hơn kích thước của chúng), lan truyền nhờ dòng nước,
không khí và côn trùng (một số loài của bộ Collembola, như Lepidocyrtus giúp nấm
Beauveria bassiana di chuyển khá xa) (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương
Giang, 1997).

2.1.5. Độc tố của nấm Beauveria bassiana
Chất diệt côn trùng của nấm Beauveria bassiana là chất chúng tiết ra khi bào tử

Hương Giang, 1997).

2.1.6. Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng
2.1.6.1. Sự xâm nhập
Các nấm diệt sâu xâm nhập vào cơ thể côn trùng qua toàn bộ vỏ cutincun ngoài
nhờ enzyme phân hủy lớp chitin của cutincun (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị
Hương Giang, 1997).
Theo Robinson R.K. (1996), sự xâm nhập của nấm diệt sâu qua lớp cutincun
ngoài được thực hiện bằng lực cơ học, còn sự tiến sâu vào lớp cutincun trong thì được
thực hiện nhờ họat động của enzyme do chính nấm tiết ra. Ngoài ra, Robinson R.K.

7
cũng xác nhận rằng các nấm diệt sâu chuyên hóa cao tạo nên trên bề mặt cutincun một
kiểu giác bám phồng lên dạng kim xuyên vào bên trong cuticun của côn trùng. Sự xâm
nhập vào xoang thân côn trùng xảy ra khá nhanh chóng, qua 32 - 48 giờ đã làm đầy cơ
thể côn trùng với những đoạn sợi nấm đơn bào tự do bơi trong huyết tương dẫn đến sự
phá hủy tiếp theo mô thân côn trùng (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị
Hương Giang, 1997).

2.1.6.2. Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết
Theo Sekhurina J. A. (1964), khi các bào tử chồi của nấm Beauveria bassiana
bắt đầu sinh sôi nảy nở trong huyết tương của bọ rùa thì bọ rùa bắt đầu tê liệt, và sau
khi vật chủ chết thì nấm mọc thành sợi nấm chui vào trong các bắp cơ và khí quản của
côn trùng; các chế phẩm mô bệnh lý nhuộm cho thấy hạch thần kinh bị biến đổi màu
do ảnh hưởng của độc tố (ở giai đoạn đầu của bệnh tê liệt các hạch thần kinh có màu
xanh tím, khi bị nấm ký sinh có màu xanh đỏ đậm trong khi đó màu của hạch thần
kinh ở côn trùng khỏe có màu xanh lá cây) (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn
Cửu Thị Hương Giang, 1997).

Hình 2.2 Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng (Scholte E-J, 2004)

trùng còn làm thay đổi độ nhớt của huyết tương. Một số các nhà nghiên cứu khác
(Dieuzeide R. 1926, Cordon T.C và Schwartz J.H. 1962) còn thấy các tinh thể được
tạo thành trong huyết tương khi côn trùng bị nhiễm nấm (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc
Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang).
Phá hủy quá trình biến thái và phát triển của côn trùng, cụ thể là các ấu trùng bị
nhiễm nấm không lột xác được (Benz G., 1963). Theo Gosswald K. (1938), nấm
Beauveria bassiana có thể nhiễm tất cả các pha phát triển của Bombyx mori. Theo
Prasertphon (1967), khi nấm B. bassiana nhiễm vào ấu trùng tuổi 4 và 5 của bọ rùa
gây hại thì biểu hiện của ấu trùng bị phá hủy như sau: ấu trùng và rệp non không thể
thoát ra khỏi tầng cutincun cứng và ở mức độ cao hơn thì côn trùng có dạng gù quái dị
(trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).

2.1.8. Các chể phẩm sinh học từ nấm Beauveria bassiana

9
Theo danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng ở Việt Nam (quyết
định số 15/2004/QD – BNN ngày 14 tháng 4 năm 2004, các loại chế phẩm nấm
Beauveria bassiana được phép sử dụng gồm có:
Boverit 5,0 x 10
8
bào tử/g (Viện Bảo vệ Thực vật) trừ rầy nâu hại lúa, sâu đo
xanh hại đay, sâu róm hại thông, sâu kèn hại tai tượng.
Biovip 1,5 x 10
9
bào tử/g (Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long) trừ rầy và bọ xít
hại lúa.
Beauverine (Công ty Thanh Sơn Hóa Nông) trừ sâu tơ hại bắp cải, sâu đục quả
hại xoài.
Muskardin (Công ty cổ phần thuốc trừ sâu Cần Thơ) trừ sâu đục thân hại lúa và
ngô.

Vùng ITS là vùng có rất nhiều sự biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử
dụng trong nghiên cứu tiến hóa của vi sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng
này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong cùng loài (Guarro,
1999).

2.2.2. Phân nhóm rDNA
Theo White và cộng sự (1989), rDNA có thể chia thành 2 nhóm: rDNA nhân
và rDNA ty thể.
rDNA nhân
rDNA nhân (nu - rDNA) gồm có nu - SSU - rDNA (17 - 18 S) mã hóa rRNA
tiểu đơn vị nhỏ (small subunit rDNA) và nu - LSU - rDNA (26 - 28 S) mã hóa rRNA
tiểu đơn vị lớn (large subunit rDNA).
Nu - SSU - rDNA tiến hóa tương đối chậm, thường được sử dụng trong nghiên
cứu các sinh vật có ít quan hệ về mặt di truyền. Nu - LSU - rDNA mặc dù có ít vùng

11
biến đổi nhưng lại rất có ý nghĩa trong nghiên cứu so sánh và phân loại ở nhiều cấp độ
(Guarro, 1999).
rDNA ty thể
rDNA ty thể (mt - rDNA) cũng gồm có hai loại: mt - SSU - rDNA (19 S) và mt
- LSU - rDNA. Các mt - rDNA tiến hóa khá nhanh, thường được sử dụng trong nghiên
cứu các sinh vật cùng họ (Yamamoto và cộng sự, 1995).
Theo nghiên cứu của Santos và cộng sự (2002), ở các loài sinh vật có lạp thể,
rDNA của lạp thể (cp - rDNA) cũng rất thay đổi về kích thước giữa các loài. Nghiên
cứu cũng kết luận rằng cp - LSU - rDNA (23 S) có sự thay đổi lớn về kích thước trong
các loài sinh vật có lạp thể, cp - SSU - rDNA (16 S) thường ít được sử dụng trong
nghiên cứu vì nó có đặc tính phái sinh. 2.2.3. Sơ lƣợc lịch sử nghiên cứu rDNA

Những năm gần đây, ngoài ý nghĩa phân loại, rDNA và vùng ITS rất được quan
tâm nghiên cứu ở cấp độ phân tử. Năm 1998, Chilton và cộng sự chứng minh cấu trúc
ITS2 bậc hai có sự tương đồng giữa các họ phụ của lớp giun tròn. Năm 1999, Joseph
và cộng sự đã chứng minh vùng trung tâm trong cấu trúc ITS2 bậc 2 của động vật có
xương sống và nấm men có nhiều điểm tương đồng. Năm 2004, Colette và cộng sự
nghiên cứu về vai trò của vùng ITS2 trong tiến trình tạo tiền rRNA ở nấm men.

2.2.4 Sơ đồ vị trí và trình tự các primer dùng trong nghiên cứu rDNA và vùng ITS
2.2.4.1 Vị trí và trình tự primer khuếch đại nu - rDNA
Vị trí primer

Hình 2.4 Sơ đồ vị trí primer trên nu - rDNA (White và cộng sự, 1989)
Các primer từ NS1 đến NS8 được thiết kế dựa trên vùng trình tự bảo tồn của
rDNA 18 S của S. cerevisiae, Distyostelium discoideum và Stylonicha pustulata. Các
primer NS1 và NS2 có thể sử dụng cho hầu hết các loại nấm, tảo đỏ và sinh vật đơn

13
bào, NS3 và NS4 dùng cho hầu hết các loại nấm, NS7 và NS8 chỉ khuếch đại được
rDNA của thực vật và động vật có xương sống. NS1 và NS8 thường dùng để đọc trình
tự hầu hết các loại rDNA nhưng không đọc được trình tự vùng primer. NS2 và NS3,
NS4 và NS5, NS6 và NS7 có trình tự bổ sung, được thiết kế để đọc được trình tự cả
vùng primer (White và cộng sự, 1989).
Các primer vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18 S, 5,8
S, 28 S. ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Primer ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng
lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8 S của N. crassa, Schizosaccharomyces pombe và
S. cerevisiae, Vicia faba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28 S của S. prombe, S,
cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Primer ITS5 có trình tự
giống với rDNA 18 S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25 bp (White và
cộng sự, 1989).


65
65
65
ITS Primer

ITS1
ITS2
ITS3
ITS4
ITS5
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
GCTGCGTTCTTCATCGATGC
GCATCGATGAAGAACGCAGC
TCCTCCGCTTATTGATATGC
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
65
62
62
58
63
Nu - LSU – Rdna
NL1F TGGGTGGTAAATTCCATCTA 51

14
NL2F
NL13
NL14
GTGAAATTGTTAAAAGGGAAAC
CAAGCGAACTTTCATCATGCACG
CTTTAGAACAAGGGTTGAAC

63
63
Mt – LSU – rDNA
ML1
GTACTTTTGCATAATGGGTCAGC
68

15
ML2
ML3
ML4
ML5
ML6
ML7
ML8
TATGTTTCGTAGAAAACCAGC
GCTGGTTTTCTACGAAACATATTTAAG
GAGGATAATTTGCCGAGTTCC
CTCGGCAAATTATCCTCATAAG
CAGTAGAAGCTGCATAGGGTC
GACCCTATGCAGCTTCTACTG
TTATCCCTAGCGTAACTTTTATC
63
67
68
66
65
63
57



16
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) được mô tả bởi Mulis và cộng sự.
(1985) là kỹ thuật cho phép làm tăng bội đáng kể các đoạn DNA cần được nghiên cứu.
Khác với sự tăng bội DNA qua sự tạo dòng nhờ vi khuẩn, PCR được thực hiện in vitro
theo con đường enzyme.

2.3.2. Nguyên tắc phản ứng PCR
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
khuôn đều cần sự hiện diện của những primer chuyên biệt. Primer là những đoạn
oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung vào đầu 3’ của khuôn, DNA polymerase
sẽ nối dài primer để hình thành mạch mới (Bùi Trang Việt, 2002).
Hiện tượng trên chính là cơ sở của phương pháp PCR. Nếu được cung cấp hai
primer (forward primer và reverse primer) có khả năng bắt cặp chuyên biệt với hai đầu
của một trình tự DNA, phản ứng PCR sẽ nhân bản trình tự nằm giữa hai primer này
(PCR thường được dùng để nhân bản các trình tự DNA có chiều dài khoảng 200-2000
bp) (Bùi Trang Việt, 2002).

2.3.3. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hƣởng
2.3.3.1. Primer và nhiệt độ lai
Primer là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới tính đặc hiệu và tính hiệu quả của
phản ứng khuếch đại. Trình tự của primer thường được chọn sao cho không có có sự
bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược, không có những cấu trúc “kẹp tóc”
do sự bắt cặp bổ sung trong mỗi primer và T
m
của 2 primer phải không quá cách biệt
nhau. Ngoài ra, thành phần nucleotide của primer phải cân bằng tránh lập lại nhiều lần
các cặp GC. Primer được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không
trùng với các trình tự trên gen. Trình tự nằm giữa hai primer không quá lớn, phản ứng
PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).

thành phần các nucleotide sẽ làm tăng các lỗi sao chép của polymerase (Hồ Huỳnh
Thùy Dương, 1998).

2.3.3.5. Mg
2+
và nồng độ Mg
2+
Mg
2+
là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA
polymerase chịu nhiệt. Nồng độ Mg
2+
ảnh hưởng mạnh tới quá trình chạy PCR. Nồng
độ Mg
2+
quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động
của Taq polymerase bị ức chế. Nồng độ Mg
2+
quá cao tuy ổn định mạch kép DNA
nhưng lại hạn chế sự biến tình hoàn toàn sản phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản
phẩm cuối cùng. Quá thừa Mg
2+
dẫn đến sự bắt cặp sai giữa primer và khuôn, kết quả
là tạo ra nhiều sản phẩm không đặc hiệu. Nồng độ tối ưu Mg
2+
phải được xác định cho
từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). 18

một lúc hiện tượng huỳnh quang ở bốn độ dài sóng khác nhau (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 1999).

19

2.4.3. Đọc trình tự sản phẩm PCR
Có hai phương pháp đọc trình tự sản phẩm PCR:
Một là, người ta sẽ tạo ra các dòng phụ (subclone) của sản phẩm PCR sau đó đọc
trình tự các subclone này.
Hai là, đọc trình tự sản phẩm PCR một cách trực tiếp, phương pháp này là một cải
tiến kỹ thuật rất quan trọng trong phân tích genome. Phương pháp này được ưa thích
sử dụng hơn vì người nghiên cứu có thể nhanh chóng có được đặc điểm của trình tự
của đối tượng nghiên cứu mà không cần phải xây dựng một kho lưu trữ clone.
2.5. Nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về nấm Beauveria bassiana
2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc
Ở nước ta kể từ năm 1990 đến nay, các nghiên cứu về nấm Beauveria bassiana
chủ yếu là các nghiên cứu về công nghệ sản xuất các chế phẩm từ nấm và hiệu suất
phòng trừ côn trùng của chúng.
Theo Phạm Thị Thùy và cộng sự (1991 - 1995), nguồn nấm Beauveria ở nước
ta khá phong phú. Chế phẩm nấm Beauveria bassiana được sản xuất bằng phương
pháp lên men xốp, sinh khối nấm đạt 5 x 10
8
bào tử/gam, thời gian thu hoạch nấm tốt
nhất theo phương pháp này là 10 ngày, chế phẩm được làm khô ở nhiệt độ 45
o
C trong
8 giờ và có thể được bảo quản trong thời gian 6 tháng. Khi thử nghiệm phương pháp

New Zealand bằng hai phương pháp RAPD và RFLP. Kết quả phân tích RAPD sử
dụng 10 primer khác nhau đã chia các giống phân lập được thành 4 nhóm có kiểu di
truyền khác nhau: nhóm nhân không đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii, nhóm B.
bassiana, nhóm B. brongniartii và một nhóm gồm các giống Beauveria khác. Sử dụng
enzyme cắt giới hạn vùng ITS của rDNA nhân cho thấy có sự khác biệt về di truyền
giữa giống B. bassiana và nhóm nhân không đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii.
Hegedus và cộng sự (1998) đã giải toàn bộ vùng gen mã hóa SSU-RNA của ti
thể nấm Beauveria bassiana. Khi so sánh trình tự này với các trình tự ở vùng tương tự
của nấm sợi thì thấy có sự khác biệt lớn. Các kết quả từ việc phân tích cây phát sinh
loài cho thấy nấm Beauveria bassiana có mối liên hệ chặt chẽ với nấm bột hơn là nấm
túi, kết quả này không giống với các kết quả so sánh trước đó tiến hành ở nấm sợi.
Theo Wang C. – Z., Li Z. – Z. và Butt T. M. (2002), các dòng đơn bào tử của
nấm Beauveria bassiana là Bb 123 (phân lập từ Ammophila sp.) và Bb 151 (phân lập
từ Brachyderes incanus) có thể được phân biệt dựa vào marker phân tử là một đoạn
intron trong vùng 11 của 28 S rDNA. Khi sử dụng hai primer I21 và I22 để khuếch đại
vùng 11 này thì sản phẩm khuếch đại của hai dòng này có kích thước không bằng
nhau. Kết quả đọc trình tự cho thấy một trong hai đoạn khuếch đại có thêm một vùng
intron 405 bp, đoạn intron này cũng có thể được phân biệt bằng phương pháp RAPD

21
với các primer : OPA - 03, OPA - 08, OPA - 11, OPA - 13, OPB - 07, OPE - 01, OPE
- 04. Thử nghiệm chủng đồng thời hai dòng nấm này trên Galleria mellonella cũng
như trên môi trường nhân tạo sau đó phân tích kết quả bằng RAPD cho thấy luôn luôn
có một dòng chiếm ưu thế hơn dòng còn lại. Hơn nữa, sự nhiễm đồng thời hai dòng
lên cùng ký chủ dẫn đến việc tạo ra các thể dị nhân, tuy nhiên các thể dị nhân này
thường không ổn định và có khuynh hướng trở lại dạng bình thường giống dòng mẹ
sau nhiều lần cấy chuyền. Các phân tích ở mức độ phân cũng cho thấy không có sự tái
tổ hợp ở các dòng phân tách từ ký chủ thí nghiệm nhiễm đồng thời hai dòng nấm trên.
Talaei - hassanloui và cộng sự (2002) đã so sánh trình tự đoạn gen mã hóa RNA
ribosom 5.8 S, vùng ITS và vùng gen mã hóa các yếu tố kéo dài trong quá trình phiên

23
Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian, địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm
Đề tài được tiến hành từ 28/2/2005 - 30/7/2005 tại phòng thí nghiệm Bảo vệ
thực vật - Khoa Nông học và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Bảo vệ thực vật -
Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh.

3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Bảng 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Ký chủ Nơi thu thập Tên khoa học Ký hiệu
Nguồn
tham khảo
Rệp vảy mềm
nâu tím
Bình Chánh
Quận 2
Pulvinaria sp.
(Coccidae-Homoptera)
PUL-BC
PUL-Q2
1
1
Sâu cuốn lá nhỏ Long An
Kiên Giang
Cnaphalocrosis medinalis
G. (Pyralidae-Lepidoptera)
SCL-LA
SCL-KG

SX-BD 1
Rầy nâu Long An Nilaparvata lugens RN-LA 1
Nhiều chủng nấm khác

24
Ghi chú:
Nguồn tham khảo (1): Lê Thị Kim Thoa, 2004.
Nguồn tham khảo (2): Mới thu thập và phân lập. .

3.2. Phân lập và nhân sinh khối các nguồn Beauveria bassiana
3.2.1. Hóa chất và dụng cụ
3.2.1.1. Hóa chất
Môi trường sử dụng: Agar, PGA, CZA
Bảng 3.2 Thành phần môi trƣờng phân lập và nhân nấm
Môi trƣờng agar (1 lít) Môi trƣờng PGA (1lít) Môi trƣờng CZA (0,5 lít)
Agar: 15 g
Nước cất một lần: 1 lít
Khoai tây: 200 g
Đường glucose: 17 g
Agar: 15 g
Nước cất một lần
Glucose: 15 g
Yeast extract: 2,5 g
NaNO
3
: 1,5 g
K
2
HPO
4

cấy 3 điểm vào môi trường PGA, để ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày. Quan sát cách
mọc bào tử của nấm dưới kính hiển vi, khi đã khẳng định nấm được phân lập là
Beauveria bassiana thì tiến hành tách đơn bào tử.
Đặt các lame sạch vào đĩa petri, hút 1 ml môi trường agar cho vào lame và trang
thành một lớp mỏng. Dùng nước cất 2 lần vô trùng để pha loãng bào tử nấm. Hút 10
ml nước cho trực tiếp vào đĩa nấm, quan sát mật độ bào tử dưới kính hiển vi và pha
loãng tới mật độ thích hợp thuận lợi cho quá trình tách đơn bào tử.
Hút 0,1 ml dịch bào tử chuyển lên lame agar đã chuẩn bị, dùng que cấy tam
giác trang đều cho đến khi bề mặt agar khô hoàn toàn. Sau 12 giờ, quan sát lame agar
dưới kính hiển vi, tìm vị trí bào tử mọc thưa, cắt phần agar chứa từng bào tử đơn
chuyển sang môi trường PGA.

3.2.3. Phƣơng pháp nhân sinh khối
Nấm sau khi phân lập được tiến hành nhân sinh khối trong môi trường CZA
(Rakotonirainy, 1991).
Cách nấu môi trường CZA: Đong 0,5 lít nước cất 2 lần cho vào becher 1 lít, đặt
lên máy khuấy từ ở 100
o
C. Cho yeast extract vào khuấy tan, tiếp tục cho các muối
NaNO
3
, K
2
HPO
4
, MgSO
4
.7H
2
O khuấy cho đến khi các muối này tan hoàn toàn thì