80

Kết quả được thể hiện trên máy tính, nhờ đó chúng ta có thể xác
định được chính xác kích thước của al, loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA)
hoặc thêm một nucleotide A,…

2.5.6.Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng primer PCR
Cách phổ biến nhất để phát hiện microsatellite là thiết kế primer PCR đặc
trưng cho một locus trong genome. Vì vậy 1 cặp primer PCR có thể áp dụng cho
mọi cá thể trong loài, và cho những sản phẩm khuếch đại có kích thước khác
nhau phụ thuộc vào chiều dài khác nhau của trình tự microsatellite.

Hình 2.6 : Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số. Hai primer PCR (2
mũi tên màu xám) được thiết kế nằm ở vùng bảo toàn nằm 2 bên trình tự
microsatellite. Nếu không có đoạn lặp lại nào, sản phẩm PCR sẽ có chiều dài là
100bp. Vì vậy, dựa vào kích thước của sản phẩm PCR chúng ta có thể tính được
số lần lặp lại của dinucleotide “CA” trong mỗi trình tự microsatellite (như trong
ví dụ này “CA” có 8 lần lặp lại với chiều dài sản phẩm PCR là 116bp).
Primer microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa
hình ở những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi al) đối với từng cá thể trong
loài. Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự
của vùng flanking- vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer-
được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng flanking rất quan trọng vì
nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc
thể.
81
Hình 2.9 : Dữ liệu microsatellite phân tích tự động bằng điện di trên
cappilary của máy giải trình tự DNA. Vị trí của các peak trên trục ngang tương
ứng với kích thước của sản phẩm PCR và chiều cao của peak biểu thị tổng lượng
sản phẩm PCR. Band chính tạo ra các peak cao hơn band phụ. MW: thang chuẩn
để xác định kích thước sản phẩm PCR.

2.5.6.1.Khả năng chuyển đổi primer microsatellite giữa các
loài
Rất nhiều microsatellite được tìm thấy ở các vùng tương ứng ở cùng gen
ở các loài khác nhau. Rất nhiều tài liệu đã công bố sự bảo tồn của microsatellite ở
các bộ gene của các loài động vật có vú như ở trâu, bò, hươu, cừu, dê. Do đó có thể
áp dụng kết quả nghiên cứu từ trâu sang bò hay các loài khác và ngược lại.
Khả năng sử dụng cùng loại primer microsatellite giữa các loài khác nhau
phụ thuộc vào sự di truyền ổn định của trình tự microsatellite và mức độ bảo tồn
(hay giống nhau) của vùng flanking (nằm ở 2 bên trình tự microsatellite) trong quá
trình tiến hóa của loài. Khả năng chuyển đổi primer microsatellite giữa các loài
khác nhau sẽ làm tăng giá trị của những primer đó, tuy nhiên số loài có khả năng
chuyển đổi primer microsatellite cũng rất giới hạn (Roder và ctv., 1995).
Khi áp dụng những cặp primer microsatellite của loài này cho loài khác,
chu trình PCR thường phải được biến đổi để thu được kết quả tốt. Thông thường
nhiệt độ bắt cặp sẽ giảm xuống từ 2-5
o

8- Dùng phương pháp lai Southern với các probe như trên để phát hiện lại
một lần nữa các đoạn DNA chứa trình tự microsatellite quan tâm.
9- Đem giải trình tự và xác định microsatellite cũng như trình tự vùng
flanking nằm ở 2 bên trình tự microsatellite, đây là vùng để thiết kế primer.
10- Chọn ra những trình tự microsatellite phù hợp nhất để thiết kế primer
(thông thường phải có ít nhất 8 lần lặp lại) tùy theo mục đích nghiên cứu.
11- Tổng hợp cặp primer đặc hiệu cho từng locus, thông thường từ 20-30 bp
nằm trong vùng flanking và không được nằm ngay sát với trình tự microsatellite.
Primer forward được đánh dấu huỳnh quang, và màu huỳnh quang của sản phẩm
khuếch đại bởi primer sẽ được phát hiện bằng tia laser khi đưa vào phân tích trình 84

tự. 2.5.7.Ưu, khuyết điểm của phương pháp microsatellite so với
các phương pháp khác
- Phương pháp microsatellite hiệu quả hơn phương pháp RFLP ở chỗ đòi
hỏi lượng DNA phân tích ít hơn, mức độ đa hình cao hơn và thêm vào đó là khả
năng phân tích tự động bằng máy giải trình tự.
- Primer microsatellite có thể được trao đổi dễ dàng giữa các nhà nghiên
cứu vì mỗi locus có mang trình tự microsatellite đều được phát hiện bởi những cặp
primer thích hợp. Primer microsatellite cũng dễ áp dụng từ loài này sang loài khác
hơn phương pháp AFLP.
- Phương pháp microsatellite cho kết quả phân tích tính đa hình chính xác
hơn, với mức độ đa hình cao gấp 7 lần so với phương pháp RAPD (Kraic và ctv.,
1998).
- Hiện nay, microsatellite là công cụ chủ yếu và đang thay thế phương pháp

20
rồi đột biến
thành AC
19.

2.5.8.Ứng dụng của microsatellite
Microsatellite được phát hiện và mô tả lần đầu ở người (Litt và Luty, 1989;
Weber và May, 1989). Những phát hiện tương tự nhanh chóng được tìm thấy ở các
loài động vật có vú như: chuột (Love và ctv.,1990), heo (Johansson và ctv., 1992)
và gia súc (Kemp và ctv., 1993). Việc ứng dụng microsatellite trong nghiên cứu di
truyền ở cây trồng mới được thực hiện trong khoảng thời gian gần đây nhưng kết
quả ứng dụng rất thành công do mức độ đa hình phát hiện bởi microsatellite cao
hơn bất kỳ marker phân tử nào khác (Saghai Maroof và ctv.,1994; Powell và ctv.,
1996). Do đó, microsatellite là một công cụ rất đắc lực trong nghiên cứu đa dạng di
truyền của cây trồng ( Yang và ctv., 1994; Xiao và ctv., 1996). Những cây trồng
được nghiên cứu dựa trên microsatellite gần đây nhất bao gồm: gạo (Wu và
Tanksley,1993), lúa mì (Saghai Maroof và ctv.,1994), lúa mạch (Roder và
ctv.,1995), thông (Karhu và ctv., 2000) và cacao (Juan Carlos Motamayor và ctv.,
2002).
Người ta nghiên cứu được rằng tần số xuất hiện của những vùng
microsatellite ở thực vật thấp hơn động vật từ 5 đến 10 lần (Lagercrantz và ctv.,
1993; Powell và ctv., 1996). Mặc dù tần số microsatellite trên DNA tế bào thực vật
thấp hơn động vật (Wang và ctv., 1994) nhưng các trình tự microsatellite có trong
DNA lục lạp là nguồn marker rất hữu ích trong nghiên cứu tính đa hình, được áp
dụng để phân loại 13 dòng Glycine (Powell và ctv., 1995). Những marker
microsatellite trong lục lạp được đánh giá là công cụ đắc lực trong nghiên cứu sự
phát sinh giống, loài và phân loại theo nguồn gốc địa lý (Doyle và ctv., 1998).
Microsatellite cũng được phát hiện trong DNA của ti thể và đã được áp dụng
nghiên cứu chuyển đổi giữa 15 loài (Soranzo và ctv., 1999).
Nhờ những tính chất của một marker, microsatellite được áp dụng trong

định được 15 cặp primer microsatellite: mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR40,
mTcCbIR33, mTcCIR1, mTcCIR60, mTcCIR22, mTcCIR24, mTcCIR15,
mTcCIR11, mTcCIR12, mTcCIR26, mTcCIR37, mTcCIR6, mTcCIR8 có hiệu quả
trong việc nhận dạng di truyền các cá thể cacao thu nhận từ ngân hàng gen cacao
Quốc tế ở Trinidad. 87

Lượng thông tin về tính đa hình thay đổi trong khoảng 0.42 đến 0.82 với giá
trị trung bình là 0.67 trong số 15 loci. Tính dị hợp thay đổi trong khoảng từ 0.51 đến
0.79. Xác suất đồng nhất tích lũy của 15 loci thay đổi từ 7.87x10
-5
và 1.485x10
-9
,
phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền của quần thể. Kết quả này cho thấy xác suất phù
hợp ngẫu nhiên giữa 2 kiểu gen thì không đáng kể.
Vì vậy, sự phối hợp 15 cặp primer SSR trên đủ cho việc nhận diện các cá thể
cacao. Sử dụng 15 cặp primer này người ta đánh giá được mức độ nhầm lẫn tên của
3 quần thể cacao thu nhận từ rừng mưa nhiệt đới Amazone vào thập niên 50. Kết
quả cho thấy chỉ 2-3% tổng số cây bị đặt tên sai. Hơn nữa, người ta cũng xác minh
lại nguồn gốc của những cây này bằng cách so sánh dữ liệu SSR của cây với những
cây lân cận trong khu vực. Do vậy, SSR marker là phương pháp hiệu quả và tin cậy
trong việc nhận diện cá thể cacao bằng đặc trưng phân tử.
(Tham khảo tại:

2.6.2.Nghiên cứu fingerprinting DNA cacao sử dụng microsatellite marker
Tại Đại Học Penn State của Mỹ, các tác giả J-D Swanson, A.C.Lee và
J.Guiltinan đã sử dụng 15 microsatellite primer trên (trong đó, 6 primer đầu tiên có

6

7

8

mTcCIR7

118-120

0

1

1

0

1

1

1

1
88


1

1

1

1

mTcCIR7

138-139

0

1

0

0

0

0

1*

0

mTcCIR7


0

0

0

1

mTcCIR7

156-158

1

1

1

0

1

1

0

1

mTcCIR7


0

0

0

mTcCIR7

190 1*

0

1

1*

1

1

0

0



0

0

0

0

0

0

1*

mTcCIR37 163 0

0

0

1

0

0

1

0
mTcCIR60 190-191

0

0

1*

0

1

1

0

1*

mTcCIR60 193 0

0

0

0


1

1

1

0

0

1

1

mTcCIR60 221 0

1

0

1*

1*

1*

1*

1


0

0

0

mTcCIR1

129-131

1

1

1*

1

1

0

1

1*

mTcCIR1

143 0


1*

mTcCIR11 129-130

0

1

1*

0

0

0

0

0

mTcCIR11 141 0

1


mTcCIR11 272 0

0

0

0

0

1*

0

0

mTcCIR11 288 0

0

0

0

1

0

0


0

0

1

mTcCIR11 314 0

1*

0

1

0

0

1

1

mTcCIR11 324 0

0

1*

0


8

mTcCIR18 320

0

1*

1*

0

0

0

0

0

mTcCIR18 330

0

0

1

0


mTcCIR18 334

0

0

1

0

1

0

0

0

mTcCIR18 342

1

1

0

1

0


0

0

0

1

0

0 mTcCIR22 120

1*

0

0


0

0

1

0

0

0

0

0

mTcCIR22 314

1*

1

0

0

1

1


mTcCIR8

239

0

1

0

0

0

1*

0

0


0

1

1

0

1

mTcCIR8

274-175

0

0

1

1

0

0

0

0


0

1

0

0

0
mTcCIR15 203

0


0

mTcCIR15 233

0

0

1

0

0

0

0

0

mTcCIR15 239

0

1

0

0


0

0

0

0

0

0

0

mTcCIR15 300

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

mTcCIR26 294-296

0

1*

1 0

1*

1

mTcCIR26 301

1


0

Trong đó:
1: kết quả điện di có hiện diện một band.
0: kết quả điện di không có band nào.
*: primer chỉ cho kết quả khuếch đại 2 trong 3 lần lặp lại thí nghiệm.
Kí hiệu của 8 giống phân tích microsatellite theo thứ tự từ 1 đến 8: