Phần 3
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.1.Vật liệu
3.1.1.Các giống cacao thí nghiệm
Các dòng cacao thí nghiệm bao gồm:
• 13 dòng cacao thương mại (được liệt kê ở bảng 3.1) được trồng tại vườn
sưu tập giống cacao, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
• 8 dòng cacao CT bao gồm: CT1, CT3, CT4, CT5, CT6, CT7, CT8 và CT9
được trồng tại 2 vườn giống cacao ở tỉnh Cần Thơ.
Ngoài ra còn có ba giống cacao: trồng tại vườn sưu tập giống cacao, Đại học
Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, được chọn để so sánh kết quả phân tích với Ngân hàng
cacao thế giới.
Cách thức lấy mẫu như sau:
• Giống ở gần phòng thí nghiệm (13 dòng cacao thương mại và 3 giống
AMAZ15/15, NA33 và PA107): chúng tôi lấy mẫu lá tại vườn và đem về
phòng thí nghiệm để ly trích DNA ngay. Vì chúng tôi quan sát thấy lá
cacao nếu lưu trữ lâu quá 24 giờ, cho dù trong tủ -20
o
C, sẽ xuất hiện nhiều
đốm nâu trên bề mặt lá làm ảnh hưởng đến chất lượng DNA ly trích.
• Giống ở xa phòng thí nghiệm (8 dòng cacao CT): mẫu lá sau khi lấy được
giữ lạnh và chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ để ly trích
DNA ngay.
Trên mỗi cây, chúng tôi chọn các lá tươi, có màu xanh thẫm nhưng không quá
già, cũng không chọn những lá non vì chúng chứa nhiều nhựa rất khó li trích, ngoài ra lá
phải không có dấu hiệu bị sâu bệnh hay côn trùng tấn công. Các mẫu lá được trữ trong
tủ -20
o
C cho đến khi tiến hành ly trích.
Những cây chọn để lấy mẫu lá (mỗi giống chọn 2 cây) được cột dây nylon màu

BAL209
BAL244
BR25
KKM
225
PBC123
PBC154
PBC157
PBC159
PBC230
PBC236
QH1213
QH22
QH441
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
36
3.1.2.Hóa chất thí nghiệm
3.1.2.1.Primer

mTcCIR11
mTcCIR15
mTcCIR18
Xanh
dương
Xanh lá
cây
Vàng
Đỏ
Xanh
dương
5’-6FAMATGCGAATGACAACTGGT-3’

GCTTTCAGTCCTTTGCTT
5’-VICCTAGTTTCCCATTTACCA-3’

TCCTCAGCATTTTCTTTC
5’-NEDTTTGGTGATTATTAGCAG-3’

GATTCGATTTGATGTGAG
5’-PETCAGCCGCCTCTTGTTAG-3’

TATTTGGGATTCTTGATG
5’-6FAMGATAGCTAAGGGGATTGAGGA-3’

• TE buffer, bao gồm 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1mM EDTA (pH 8.0).
• CIA, bao gồm 24V chloroform: 1V isoamylalcohol.
• Isopropanol.
• Sodium acetate.
• Ethanol 70% and 96%.
• RNase.
• Low-salt TE (10 mM Tris-HCl , 1mM EDTA [pH 8.0]).
3.1.2.3.Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR
• 10X PCR buffer (do công ty BioRad cung cấp).
• 25mM MgCl
2
(do công ty BioRad cung cấp).
• 10mM dNTP’s (do công ty Applied-Biosystem-Mỹ cung cấp).
• Taq DNA polymerase (do công ty BioRad cung cấp)
38
• Primer (do công ty Applied-Biosystem-Mỹ cung cấp).
• DNA mẫu (ly trích từ lá cacao).
• H
2
O cất 2 lần, siêu lọc, hấp khử trùng.
3.1.2.4.Các hóa chất dùng trong phân tích trình tự
• Sản phẩm PCR.
• Chất làm biến tính DNA: Hidi Formamide
• Chất chuẩn để xác định kích thước của các peak (size standard).
• Polymer pop 6-ABI.
• Buffer.
3.1.3.Trang thiết bị thí nghiệm
• Chén sứ và chày giã (Đức)
• Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml (Mỹ)
• Cân phân tích 4 số (Ohaus - Mỹ)

dòng. Ghi nhận dữ liệu microsatellite của 21 dòng cacao với 5 primer.
• Giai đoạn 2: Kiểm tra độ chính xác và tính ổn định của phương pháp nhận
diện.qua 2 bước:
1. Thu nhận mẫu lá của 13 dòng cacao thương mại cũng từ vườn giống cacao tại
Đại Học Nông Lâm, 13 dòng này đã được người lấy mẫu mã hoá tên giống dưới dạng:
A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14 (các mã số này được giữ
kín cho đến khi thu được kết quả cụ thể). Tiến hành các bước phân tích như ở giai đoạn
40