10
gen nhờ Agrobacterium tumefaciens hay nhờ súng bắn gen (Firoozabady và ctv, 1987;
Perlak và ctv, 1990). Ngoài ra còn có các mô phân sinh phân lập từ trục phôi đã được sử
dụng cho việc chuyển gen bằng súng bắn gen ở bông vải (Chlan và ctv, 1995).
Tuy nhiên tỉ lệ chuyển gen thường khá thấp, khoảng 20 - 30% khi trụ hạ diệp được
dùng làm mẫu cấy (Firoozabady và ctv, 1987; Rajasekaran và ctv, 1996). Một hiệu quả
chuyển gen cao hơn có ý nghĩa (đến 60%) đã được công bố khi trụ hạ diệp được dùng làm
mẫu cấy và gen onc (mã hóa cho enzyme tổng hợp octopin-octopin synthase) được dùng
làm gen chỉ thị (Firoozabady và ctv, 1987). Nhưng chỉ là kết quả của sự thử nghiệm sự biểu
hiện gen tạm thời của gen onc. Một báo cáo gần đây cho rằng hiệu quả chuyển nạp gen ở
song tử diệp chỉ khoảng 20 -30% (Cousins và ctv,1991), hiệu quả chuyển nạp gen thậm chí
còn thấp khi sử dụng phương pháp bắn gen (Keller và ctv, 1997. Sự khác biệt giữa các loại
mẫu cấy được dùng trong chuyển nạp gen có thể ảnh hưởng có ý nghĩa đến hiệu quả của
chuyển nạp gen và sự tái sinh, một số nhà nghiên cứu cho rằng để giảm thiểu các thể
chuyển nạp gen dương tính giả, tử diệp là mẫu cấy tốt hơn trụ hạ diệp (Firoozabady và ctv,
1987). Sunilkumar và Rathore (2001) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả
chuyển nạp gen trên cây bông vải bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho thấy các
yếu tố như chủng vi khuẩn, acetosyringone và nhiệt độ trong chuyển gen có ảnh hưởng
đáng kể đến hiệu quả chuyển gen. Thêm vào đó kích thước mẫu cấy cũng ảnh hưởng đến sự
sống sót của các mẫu cấy trên môi trường chọn lọc (Sunilkumar và Rathore, 2001).
Sự chuyển nạp gen cũng phụ thuộc vào kiểu gen. Chỉ có một số giống nhất định mới
có khả năng tái sinh và chuyển nạp như giống bông Luồi Coker 312 và Jin 7, còn hầu hết
các giống khác thường khó có thể tái sinh và chuyển nạp được. Thiếu phương pháp tái sinh
cây hiệu quả cũng được xem như là một rào cản chính cho việc áp dụng phương pháp
chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải (Firoobady và ctv, 1987). Để cải
tiến phương pháp chuyển nạp, một quy trình chuyển gen hiệu quả cao dùng cuống lá và trụ
hạ diệp cây mầm làm mẫu cấy được phát triển, cùng với môi trường nuôi cấy được cải tiến
thích hợp. Hiện nay, Trung Quốc đã thành công trong việc chuyển nạp gen vào cây bông
vải bằng phương pháp tiêm DNA qua ống phấn, nhưng phương pháp này gặp khó khăn
trong việc xác định cây chuyển gen vì rất nhiều cây được tạo thành nhưng chỉ một số ít cây

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích thước là 2,6Mb. Ngoài ra vi khuẩn

12
còn mang plasmid lớn có kích thước 200 - 800 kb (Gelvin, 2003), chính plamid này là
nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập. Plasmid này có tên gọi là
Plasmid Ti, hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên plasmid này (Deacon và ctv, 2005).
Khi rễ cây xuất hiện vết thương thì tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thương và xâm
nhập vào cây qua vết thương đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số
đó là Plasmid Ti. Plasmid Ti mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào
cây. Những vi khuẩn không mang Plasmid Ti thì được xem như là vi khuẩn không độc và
không có khả năng gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ màu trắng, ban
đầu được tìm thấy ở gốc cây. Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do
các tế bào ngoại biên chết đi. Các khối u có thể mền và xốp và có thể bị vỡ vụn khi chạm
vào, nhưng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ. Các khối u có đường kính đến 30 cm
nhưng phổ biến là 5 – 10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất
nhạy cảm với các điều kiện môi trường. Khi xâm nhiễm vào cây một phần gen trên Plasmid
Ti sẽ gắn vào bộ gen của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc
biệt gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này như một nguồn cacbon

2.3.2. Ti-plamid
Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn và có khả
năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định Plasmid Ti như một
nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bước khởi động của một
giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens. Điều này đã mở ra khả
năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi
Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000).
Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T- DNA mang các gen tổng hợp các hormon
thực vật và vùng gen vir, ngoài ra còn có một số gen mã hoá cho việc tái sinh plasmid, cho
việc tiêu hoá opine. Trong cấu trúc của Plasmid Ti , hai yếu tố quan trọng cần cho sự
chuyển gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của đoạn T-

Một nhóm gen được chuyển thứ hai đều khiển sản xuất nguồn dinh dưỡng cho vi
khuẩn, đó là các opine. Đây là một dạng kết hợp giữa một aminoacid với một keto acid
hoặc một đường (Dessaux và ctv, 1998). Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số
lượng lớn các opine. Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài
vùng T-DNA và thường trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine được tổng hợp
từ khối u. Dựa trên các kiểu opine đựơc tạo ra từ các khối u mà phân chia nhóm vi khuẩn
Agrobacterium thành các chủng như là: octopine, nopaline, succinamopine và leucinopine.
Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine
chuyên biệt (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). Gen ocs mã hóa cho

14
octopine synthase, enzyme này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để
tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic acid và tất cả những opine này đều được
phát hiện trong các khối u (Dessaux và ctv, 1998). Sản phẩm của gen mas2’ được cho là
làm kết nối glutamine hoặc glutamic acid với glucose (mặc dù đều này chưa đựơc chứng
minh bằng thực nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung
gian mannopine và mannopinic acid. Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa mannopine
thành agropine. Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa thành agropinic acid
(Dessaux và ctv, 1998). Bởi vậy, các khối u được tạo ra bởi Plasmid Ti kiểu octopine có
thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine.

2.3.2.2 Chức năng của các gen vir
Vùng vir trên Plasmid Ti có khoảng 25 gen được nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là:
virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2002) và vùng này có
kích thước khoảng 30- 40 kbp (Riva và ctv, 1998). Những gen vir này mã hoá cho các vai
trò như: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, gia công đoạn T-DNA,
chuyển nạp đoạn T-DNA và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T-DNA vào tế bào kí
chủ.
Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua dấu hiệu
hoá học tiết từ vết thương. Các tín hiệu hoá học từ vết thương ở tế bào cây chủ tạo ra được

chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv, 2000). Ngoài ra, Protein VirD2 được cho là
có chức năng trong sự hòa hợp T-DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đưa T-DNA
vào nhân tế bào và lưu lại cùng với T-DNA trong các bước hòa hợp. Hai giả thuyết về chức
năng của protein VirD2 trong sự hòa hợp T-DNA đã được đề nghị: VirD2 hoạt động như
một integrase và VirD2 hoạt động như một ligase (Ziemienowicz, 2001).
Hệ thống chuyển nạp T-DNA được mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11
gen. Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột
biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo
khối u và tạo khối u (Lai và Kado, 1998). Các protein VirB đều khiển tạo chiên mao và
VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai protein VirB là VirB4 và VirB11 có hoạt
tính ATPase và được cho là cung cấp năng lượng cho việc xuất các tiểu phần protein khác,
cho vận chuyển T-DNA. Hệ thống VirB đưa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây
các bước cần cho chuyển T-DNA vào nhân và hòa hợp với DNA của cây được thực hiện
(Zhu và ctv, 2000).

16

Hình 2.2. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây
(nguồn Zhu và ctv, 2000)

2.3.2.3 Cơ chế lây nhiễm
Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề mặt rễ
cây. Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất
dinh dưỡng do mô rễ tạo ra. Vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây bị tổn thương do
nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến
vị trí vết thương nhờ các dấu hiệu hoá học. Đều này có được là do đáp ứng giải phóng
đường và các thành phần phổ biến khác trong rễ. Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn mang
Plasmid Ti sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thương (hợp chất
phenolic) như acetosyringone. Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng độ thấp (10
-7

vi khuẩn (Valentine, 2003 ).

Hình 2.4. Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây
(Valentine, 2003 )

18
CHƢƠNG 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải Coker 312 và VN36P
bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, sử dụng plasmid pManCa (Hoa và Bong, 2003)
mang gen pmi và gen gus để xây dựng quy trình chuyển nạp gen với hệ thống thanh lọc
bằng mannose đối với cây bông vải.

3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian: khóa luận được thực hiện từ ngày 21/03/2005 đến ngày 31/07/2005.
Địa điểm: khóa luận được thực hiện tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng
Bằng Sông Cửu Long, huyện Cờ Đỏ, TP. Cần Thơ.

3.3. Vật liệu nghiên cứu
Giống bông vải Coker 312 và VN36P. Hạt bông vải tự thụ được thu từ cây bông vải
trồng ở nhà lưới của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Mẫu cấy: trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi.
Dụng cụ, thiết bị, hoá chất ở bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng
Sông Cửu Long (phụ lục 7).

3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1.Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy
Hạt của các giống bông vải được đốt lớp xơ bao quanh bằng axit sunfurit đậm đặc