1
CHƢƠNG 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Bông vải (Gossypium hirsutum.L) là cây trồng lấy sợi quan trọng hàng đầu để thoả
mãn một trong những nhu cầu bức thiết của con người là mặc, đồng thời cũng là cây lấy
dầu từ hạt quan trọng thứ hai trên thế giới sau cây đậu tương (Nobre và ctv, 2001). Cây
bông vải được trồng khắp nơi trên thế giới. Trong các nước trồng bông vải thì Ấn Độ là
nước sản xuất bông vải lớn nhất, đứng đầu về diện tích (khoảng 9,7 triệu ha) chiếm 32%, kế
đến là Mỹ chiếm 24% và Trung Quốc chiếm 20% diện tích trồng bông vải toàn cầu
(Satyavathi và ctv, 2002).
Ở Việt Nam nghề trồng bông vải có từ ngàn xưa và từng là loại cây trồng quan trọng
ở vùng Duyên Hải Trung Bộ trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp. Sau năm 1975, nhà
nước ta nhiều lần cố gắng tổ chức trồng bông ở đây nhưng không thành công do giá cả thị
trường bấp bênh và không phòng trừ được sậu đục quả bông một cách hiệu quả dẫn đến
người trồng bông thua lỗ, diện tích trồng bông không thể phát triển được.
Trong những năm gần đây, do áp dụng những tiến bộ khoa học và công nghệ đã cho
ra đời các giống bông lai kháng sâu và có năng suất cao để đưa vào sản xuất. Tuy nhiên sản
lượng bông xơ chỉ đáp ứng một phần nhỏ (10 - 15%) nhu cầu nguyên liệu cho ngành dệt
may. Dự kiến đến năm 2010, sản lượng bông xơ đáp ứng 20% nhu cầu trong nước, đưa
diện tích trồng bông tăng lên 1 triệu ha, tập trung ở vùng Duyên Hải Miền Trung, Tây
Nguyên, Đông Nam Bộ và Đồng Bằng Sông Cửu Long ( Bộ Nông Nghiệp và PTNT,
2003).
Từ lâu người ta đã quan tâm nhiều đến việc cải thiện đặc tính di truyền của các loài
cây bông vải. Mặc dù có nhiều giống bông vải tốt được tạo ra theo các phương pháp lai tạo
và chọn lọc truyền thống, nhưng dường như các giống bông đó khó có thể khai thác được
các nguồn gen có lợi một cách hiệu quả. Việc ứng dụng công nghệ di truyền thực vật có thể
thúc đẩy việc tạo ra các giống cây bông có nhiều đặc tính ưu việt về đặc tính nông học như
tính kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ và tính chống chịu với các đều kiện bất lợi của môi

phương pháp được ưu chuộng hiện nay (Chen và ctv, 2000).
Cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào được thực hiện để tìm hiểu khả năng
chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên các giống bông vải đang
trồng ở Việt Nam. Vì vậy việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của
ba giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ” là một
vấn đề cần thiết

3
1.2. Mục tiêu của khóa luận
Tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải Coker 312 và VN36P
bằng phương pháp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và hệ thống chọn lọc bằng
mannose để thanh lọc mô sẹo sau khi được chuyển nạp.

1.3. Hạn chế của khóa luận
Do thời gian thực hiện ngắn nên khóa luận chỉ thực hiện xong giai đoạn thanh lọc
(qua 3 vòng) mô sẹo đã được chuyển nạp gen trên hai giống Coker312 và VN36P. Giai
đoạn thử nghiệm sự biểu hiện gen chỉ thị gus (β-glucuronidase) tạm thời các mô sẹo đã qua
thanh lọc chưa có điều kiện thực hiện.

mặt lá phẳng. Cành lá khỏe, số lượng lá nhiều, quả tròn, mặt quả nhẵn, trọng lượng hạt
bông trung bình trong một quả đạt 5 - 6g. Loài G. hirsutum xuất xứ từ Trung Mỹ, du nhập
vào Việt Nam khoảng cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX. Loài này có khả năng thích ứng
rộng, phù hợp với đều kiện trồng nhờ nước trời ở nước ta, với tiềm năng cho năng suất cao
và có chất lương xơ tốt, các giống bông này dần thay thế các giống bông Cỏ trước đó. Bông
Luồi được trồng nhiều nhất ở Mỹ, Nga, Ấn Độ, Mêhico, Trung Quốc, Braxin… Bông Luồi

5
có nhiều loài phụ như : G.hirsutum ssp. Mexicanum, G.hirsutum ssp. punctatum,
G.hirsutum ssp. panicultum…

2.1.2.3. Gossypium barbadense
Loài Gossypium barbadense còn gọi là bông Hải Đảo, cây tương đối to, chín muộn,
lá to, khía sâu, màu xanh đậm. Thân cành lá gần như không có lông, đài không có răng cưa
rõ rệt và thường chỉ gợn hình làn sóng. Hạt thường nhẵn, không có xơ ngắn, xơ dài màu
trắng hoặc cà phê sữa. Loài G. barbadense có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nay được trồng nhiều
ở Nga, Mỹ, Ai Cập và một số nước khác. Loài này thường gặp dưới dạng cây bông lâu năm
ở trong các vườn hoang và bờ dậu. Bông Hải Đảo chỉ thích hợp trong vụ khô có tưới, không
thích hợp với đều kiện mưa nhiều, độ ẩm cao. Bông Hải Đảo có nhiều loài phụ như: G.
barbadense ssp. darwinii, G. barbadense ssp. ruderale, G. barbadense ssp. ventiforlum.
Hiện nay loài này được nghiên cứu trong chương trình tạo giống bông lai giữa bông
Luồi với bông Hải Đảo nhằm mục đích khai thác khả năng cho năng suất cao của bông
Luồi kết hợp với chất lượng xơ tốt của bông Hải Đảo.

2.1.2.4. Gossypium herbaceum
Loài này phân bố chủ yếu ở các sa mạc, khí hậu khô nóng như vùng Trung Á, Tây
Bắc Trung Quốc, Châu Phi, chưa thấy trồng ở Việt Nam.

2.1.2.5. Gossypium tricuspidatum
Loài này khá giống loài G. hirsutum, cây và lá to, chín hơi muộn, xơ dài và mịn. Loài

2004).
Từ sau những năm 1990, ngành bông Việt Nam có những bước thay đổi mạnh mẽ,
chúng ta đã tạo được các giống bông, đặc biệt là các giống bông lai có năng suất cao, chất
lượng xơ tốt, chống chịu được sâu bệnh. Hàng loạt các tiến bộ kỹ thuật được áp dụng như:
áp dụng biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp giúp giảm chi phí thuốc bảo vệ thực vật, các
biện pháp kỹ thuật canh tác khác như hệ thống luân canh xen canh hợp lý, phủ màng PE
cho bông, phun các chất đều hòa tăng trưởng… chính vì vậy mà năng suất và chất lượng
bông xơ tăng, nghề sản xuất bông cho hiệu quả kinh tế cao. Hiện nay, diện tích đã đạt hơn
35000 ha, năng suất đạt hơn 11 tạ/ha, tăng gấp hai lần so với bình quân trước đây (Bảng
2.1). 7
Bảng 2.1. Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam trong những năm qua.
(Nguồn: Lê Quang Quyến, 2004).
Niên Vụ Diện tích (ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (tấn)
1996/1997
1997/1998
1998/1999
1999/2000
2000/2001
2001/2002
2002/2003
10676
11716
19963
17705
13250
29573
35200

7,2 triệu ha trong năm 2003). Trong số các nước trồng bông chuyển gen, Ấn Độ là nước có
diện tích trồng bông chuyển gen tăng nhanh nhất thế giới (tăng 400% so với năm 2003).
Năm 2003, Ấn Độ chỉ có 100 ngàn ha bông chuyển gen nhưng năm 2004 diện tích bông
chuyển gen tăng lên 500 ngàn ha. Trung Quốc cũng là nước có sự gia tăng diện tích trồng
bông chuyển gen đáng chú ý: năm 2003 có 2,8 triệu ha nhưng năm 2004 đã tăng lên 3,7
triệu ha (chiếm 60% diện tích bông). Theo dự báo của các chuyên gia thì diện tích trồng

8
bông chuyển gen trên thế giới sẽ tiếp tục gia tăng trong những năm tới và hướng chuyển
gen vào cây bông sẽ tập trung vào việc tạo ra các giống bông kháng sâu bệnh là chủ yếu
(James, 2004)

Bảng 2.2. Mười nước có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới năm 2001- 2002.
(ISAAA, 2002)
STT Quốc gia Triệu ha
1 Ấn Độ 8,730
2 Mỹ 5,596
3 Trung Quốc 4,824
4 Pakistan 3,125
5 Uzbekistan 1,453
6 Brazil 0,750
7 Thổ Nhĩ Kỳ 0,654
8 Turkmenistan 0,550
9 Mali 0,516
10 Benin 0,415
TỔNG CỘNG 26,613
Diện tích trồng bông của thế giới 33,457
Nguồn: ICAC, 2002 (http://www.isaaa.org/)

9

mẫu cấy là trụ hạ diệp và tử diệp. Từ đó nhiều gen được chuyển thành công vào cây bông
nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, bao gồm các gen kháng côn trùng và gen kháng
thuốc diệt cỏ (Perlak và ctv, 1990; Chen và ctv, 1994). Các loại mẫu cấy như trụ hạ diệp, tử
diệp, mô sẹo từ trụ hạ diệp và tử diệp cũng như phôi non đã được dùng trong việc chuyển

10
gen nhờ Agrobacterium tumefaciens hay nhờ súng bắn gen (Firoozabady và ctv, 1987;
Perlak và ctv, 1990). Ngoài ra còn có các mô phân sinh phân lập từ trục phôi đã được sử
dụng cho việc chuyển gen bằng súng bắn gen ở bông vải (Chlan và ctv, 1995).
Tuy nhiên tỉ lệ chuyển gen thường khá thấp, khoảng 20 - 30% khi trụ hạ diệp được
dùng làm mẫu cấy (Firoozabady và ctv, 1987; Rajasekaran và ctv, 1996). Một hiệu quả
chuyển gen cao hơn có ý nghĩa (đến 60%) đã được công bố khi trụ hạ diệp được dùng làm
mẫu cấy và gen onc (mã hóa cho enzyme tổng hợp octopin-octopin synthase) được dùng
làm gen chỉ thị (Firoozabady và ctv, 1987). Nhưng chỉ là kết quả của sự thử nghiệm sự biểu
hiện gen tạm thời của gen onc. Một báo cáo gần đây cho rằng hiệu quả chuyển nạp gen ở
song tử diệp chỉ khoảng 20 -30% (Cousins và ctv,1991), hiệu quả chuyển nạp gen thậm chí
còn thấp khi sử dụng phương pháp bắn gen (Keller và ctv, 1997. Sự khác biệt giữa các loại
mẫu cấy được dùng trong chuyển nạp gen có thể ảnh hưởng có ý nghĩa đến hiệu quả của
chuyển nạp gen và sự tái sinh, một số nhà nghiên cứu cho rằng để giảm thiểu các thể
chuyển nạp gen dương tính giả, tử diệp là mẫu cấy tốt hơn trụ hạ diệp (Firoozabady và ctv,
1987). Sunilkumar và Rathore (2001) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả
chuyển nạp gen trên cây bông vải bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho thấy các
yếu tố như chủng vi khuẩn, acetosyringone và nhiệt độ trong chuyển gen có ảnh hưởng
đáng kể đến hiệu quả chuyển gen. Thêm vào đó kích thước mẫu cấy cũng ảnh hưởng đến sự
sống sót của các mẫu cấy trên môi trường chọn lọc (Sunilkumar và Rathore, 2001).
Sự chuyển nạp gen cũng phụ thuộc vào kiểu gen. Chỉ có một số giống nhất định mới
có khả năng tái sinh và chuyển nạp như giống bông Luồi Coker 312 và Jin 7, còn hầu hết
các giống khác thường khó có thể tái sinh và chuyển nạp được. Thiếu phương pháp tái sinh
cây hiệu quả cũng được xem như là một rào cản chính cho việc áp dụng phương pháp
chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải (Firoobady và ctv, 1987). Để cải

khuẩn này phát triển tối ưu ở nhiệt 29
o
C trong môi trường có bổ sung mangan và succinate
như là nguồn cacbon duy nhất (Domer, 1999). Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây
bệnh khối u trên cây (chủ yếu là cây hai lá mầm) khi xâm nhiễm vào cây. Bộ nhiễm sắc thể
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích thước là 2,6Mb. Ngoài ra vi khuẩn

12
còn mang plasmid lớn có kích thước 200 - 800 kb (Gelvin, 2003), chính plamid này là
nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập. Plasmid này có tên gọi là
Plasmid Ti, hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên plasmid này (Deacon và ctv, 2005).
Khi rễ cây xuất hiện vết thương thì tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thương và xâm
nhập vào cây qua vết thương đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số
đó là Plasmid Ti. Plasmid Ti mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào
cây. Những vi khuẩn không mang Plasmid Ti thì được xem như là vi khuẩn không độc và
không có khả năng gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ màu trắng, ban
đầu được tìm thấy ở gốc cây. Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do
các tế bào ngoại biên chết đi. Các khối u có thể mền và xốp và có thể bị vỡ vụn khi chạm
vào, nhưng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ. Các khối u có đường kính đến 30 cm
nhưng phổ biến là 5 – 10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất
nhạy cảm với các điều kiện môi trường. Khi xâm nhiễm vào cây một phần gen trên Plasmid
Ti sẽ gắn vào bộ gen của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc
biệt gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này như một nguồn cacbon

2.3.2. Ti-plamid
Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn và có khả
năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định Plasmid Ti như một
nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bước khởi động của một
giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens. Điều này đã mở ra khả
năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi

6b). Sản phẩm của gen 5 điều khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng
đẳng với auxin (Korber và ctv,1991). Trong khi đó gen tml làm tăng mức độ nhạy cảm của
các tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chưa được giải thích (Tinland và ctv,
1992). Gen tml có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u
khác.
Một nhóm gen được chuyển thứ hai đều khiển sản xuất nguồn dinh dưỡng cho vi
khuẩn, đó là các opine. Đây là một dạng kết hợp giữa một aminoacid với một keto acid
hoặc một đường (Dessaux và ctv, 1998). Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số
lượng lớn các opine. Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài
vùng T-DNA và thường trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine được tổng hợp
từ khối u. Dựa trên các kiểu opine đựơc tạo ra từ các khối u mà phân chia nhóm vi khuẩn
Agrobacterium thành các chủng như là: octopine, nopaline, succinamopine và leucinopine.
Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine
chuyên biệt (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). Gen ocs mã hóa cho

14
octopine synthase, enzyme này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để
tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic acid và tất cả những opine này đều được
phát hiện trong các khối u (Dessaux và ctv, 1998). Sản phẩm của gen mas2’ được cho là
làm kết nối glutamine hoặc glutamic acid với glucose (mặc dù đều này chưa đựơc chứng
minh bằng thực nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung
gian mannopine và mannopinic acid. Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa mannopine
thành agropine. Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa thành agropinic acid
(Dessaux và ctv, 1998). Bởi vậy, các khối u được tạo ra bởi Plasmid Ti kiểu octopine có
thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine.

2.3.2.2 Chức năng của các gen vir
Vùng vir trên Plasmid Ti có khoảng 25 gen được nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là:
virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2002) và vùng này có
kích thước khoảng 30- 40 kbp (Riva và ctv, 1998). Những gen vir này mã hoá cho các vai

cho là có chức năng trong việc tạo gia công T-DNA là: VirC1 và VirC2. VirC1 đã được
thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cường
sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease (Gelvin, 2003). Một số tác giả
khác cho rằng VirC1 và VirC2 không cần cho tạo sợi đơn T-DNA nhưng khi vắng mặt hai
protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp. Do đó đề nghị rằng chúng có
chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv, 2000). Ngoài ra, Protein VirD2 được cho là
có chức năng trong sự hòa hợp T-DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đưa T-DNA
vào nhân tế bào và lưu lại cùng với T-DNA trong các bước hòa hợp. Hai giả thuyết về chức
năng của protein VirD2 trong sự hòa hợp T-DNA đã được đề nghị: VirD2 hoạt động như
một integrase và VirD2 hoạt động như một ligase (Ziemienowicz, 2001).
Hệ thống chuyển nạp T-DNA được mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11
gen. Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột
biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo
khối u và tạo khối u (Lai và Kado, 1998). Các protein VirB đều khiển tạo chiên mao và
VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai protein VirB là VirB4 và VirB11 có hoạt
tính ATPase và được cho là cung cấp năng lượng cho việc xuất các tiểu phần protein khác,
cho vận chuyển T-DNA. Hệ thống VirB đưa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây
các bước cần cho chuyển T-DNA vào nhân và hòa hợp với DNA của cây được thực hiện
(Zhu và ctv, 2000).

16

Hình 2.2. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây
(nguồn Zhu và ctv, 2000)

2.3.2.3 Cơ chế lây nhiễm
Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề mặt rễ
cây. Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất
dinh dưỡng do mô rễ tạo ra. Vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây bị tổn thương do
nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến