19
Sau khi bảo hòa qua đêm, hạt tiếp tục được khử trùng bằng HgCl
2
0,1% có vài giọt
Tween 20 (thực hiện 2 lần mỗi lần 5 phút). Sau đó những hạt nứt nanh được bóc vỏ trong
đều kiện vô trùng và cấy vào môi trường nảy mầm MSG (phụ lục 1) và nuôi ở nhiệt độ 28 -
29
0
C, độ ẩm tương đối bằng 50%.
Sau 5-7 ngày ta loại bỏ những keo bị tạp nhiễm, chọn những cây không bị tạp nhiễm
làm nguồn vật liệu thí nghiệm. Từ cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi đã được nuôi cấy, các
trụ hạ diệp được cắt thành những đoạn dài khoảng 0,5 cm dùng làm vật liệu cho nghiên cứu
chuyển nạp gen. Hình 3.1. Hạt bông vải sau khi tách vỏ và cấy vào môi trường nảy mầm Hình 3.2. Cây mần in vitro 5 ngày tuổi. 20
3.4.2. Quy trình chuyển nạp gen
3.4.2.1. Nguồn plasmid
Nguồn plasmid được sử dụng để nghiên cứu là vector pManCa (Hoa và Bong, 2003)
mang gen pmi (phosphomannose isomerase) giúp tế bào vi khuẩn biến dưỡng đường
mannose và gen chỉ thị gus trong chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404
(Hoekema và ctv, 1983).

Hình 3.3. Sơ đồ vector pManCa mang gen pmi và gen gus


21
Vi khuẩn sau khi chuẩn bị được đem li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút.
Sau khi li tâm, phần lắng được pha loãng bằng môi trường lây nhiễm không có phytagel (có
bổ sung AS) và lắc với tốc độ 220 vòng/phút ở 28
0
C trong 1giờ để chuẩn bị cho lây nhiễm.
Từ cây mầm in vitro đã được chuẩn bị ta cắt lấy đoạn trụ hạ diệp, sau đó đoạn cắt trụ
hạ diệp được cắt thành những mẫu dài khoảng 0,5 cm rồi ngâm trong dịch vi khuẩn pha
loãng (OD
600
~ 0,5) khoảng 30 phút. Sau khi lây nhiễm các mẫu cấy được chuyển vào đĩa
petri có giấy thấm tuyệt trùng cho khô mẫu sau đó cấy sang đĩa petri có môi trường đồng
nuôi cấy MSCo (phụ lục 2).
Các đĩa mẫu sau đó được giữ trong tủ nuôi ở 21
0
C trong đều kiện chiếu sáng liên tục
khoảng 72 giờ.

3.4.2.4. Thanh lọc
Sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn, mẫu cấy được rửa vi khuẩn bằng nước cất vô
trùng 2 lần để loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bám trên bề mặt mẫu cấy và
kháng sinh carbernicillin 500 mg/l để ức chế vi khuẩn mọc trở lại. Sau khi rửa, mẫu cấy
được đặt lên đĩa petri có giấy thấm vô trùng trong vài phút cho khô mẫu. Sau đó mẫu cấy
được cấy chuyền lên môi trường thanh lọc MMS1 (phụ lục 3) có tác nhân thanh lọc là
đường mannose và glucose ở các nồng độ khác nhau theo sự tăng dần nồng độ mannose
(2,5% w/v, 30% w/v và 35% w/v) và giảm dần nồng độ glucose (10% w/v, 5% w/v và 0%
w/v) qua 3 lần thanh lọc, mỗi lần cách nhau 2 tuần.

Bảng 3.1. Nồng độ đường mannose và glucose ở các lần thanh lọc
23
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Sự hình thành và phát triển mô sẹo
Trong nghiên cứu chuyển nạp gen với mẫu cấy là trụ hạ diệp thì sự hình thành và phát
triển của mô sẹo có một ý nghĩa rất quan trọng. Từ các mô sẹo được hình thành sau khi lây
nhiễm và qua quá trình thanh lọc chúng ta có thể chọn ra được các mô sẹo chuyển gen có
khả năng tái sinh để tiếp tục tái sinh thành cây chuyển gen.
Sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1 thì mô sẹo đều bắt đầu hình thành và phát
triển ở cả mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm. Mô sẹo có màu xanh lá cây tuy nhiên ở mẫu
đối chứng sự phát triển của mô sẹo đồng đều hơn so với mẫu lây nhiễm có thể là do mẫu lây
nhiễm bị tổn thương do ngâm trong dịch vi khuẩn và rửa lại bằng nước và kháng sinh khi
tiến hành lây nhiễm (Hình 4.2). Hình 4.1. Mẫu cấy giống Coker 312 sau khi lây nhiễm trên môi trường MSCo 24

Hình 4.2. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1.
A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm

Hai tuần trên môi trường thanh lọc lần 2, mô sẹo phát triển thành một khối to gấp 3 –
4 lần so với mô sẹo trên môi trường thanh lọc lần 1 (Hình 4.3). So sánh giữa đối chứng và
mẫu lây nhiễm ta thấy ở mẫu đối chứng thì khối mô sẹo cứng, có màu xanh đậm còn ở mẫu
lây nhiễm thì mô sẹo có màu xanh hơi vàng và chắc, một số mô sẹo có xu hướng rời ra khi

này được tách nhỏ và tiếp tục cấy chuyền lên môi trường thanh lọc giống như ở lần 3 (Hình
4.7). Sau 2 tuần quan sát chúng tôi thấy các mô sẹo được tách nhỏ từ mẫu đối chứng điều bị
chết còn ở mẫu lây nhiễm thì một số mô sẹo tiếp tục phát triển có màu xanh vàng, rời rạc,
đây là các mô sẹo đáp ứng tốt với khả năng tái sinh và có khả năng sinh phôi tốt (Mishra và
ctv, 2002; Sakhanokho và ctv, 2001). Tuy nhiên số mô sẹo chuyển màu nâu đen trong
nghiệm thức chuyển gen cũng rất nhiều. Ở các mô sẹo chết và trên một số mô sẹo hóa nâu
chúng tôi thấy có xuất hiện các mô sẹo mới. Các mô sẹo này có thể là những mô sẹo được
chuyển nạp gen (Hình 4.8). Hình 4.6. Mẫu cấy giống Coker 312 chết trên môi trường thanh lọc lần 3.
A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm Hình 4.7. Khối mô sẹo giống Coker 312 sau khi thanh lọc lần 3.
A: mô sẹo được tách nhỏ và chuyển tiếp lên môi trường thanh lọc lần 3, B: mô sẹo không
được tách và chuyển lên môi trường thanh lọc lần 3. 27

Hình 4.8. Mô sẹo giống VN36P được tách nhỏ sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3
A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm.

4.2. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau các lần thanh lọc
Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong
nuôi cấy mô thông thường và chuyển gen. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành theo
dõi sự hình thành mô sẹo của các mẫu cấy sau khi kết thúc mỗi lần thanh lọc (thời gian cho
mỗi lần thanh lọc là 2 tuần).


34
146
34
143
100
97,9
3
36
147
36
144
100
97,9
4
34
143
34
139
100
97,2

Trung bình
100
97,6