21
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện từ ngày 1 tháng 3 năm 2005 đến ngày 1tháng 8 năm 2005
tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử thuộc Bộ Môn Di truyền và Chọn giống ở
Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Ô Môn, TP. Cần Thơ.

3.2. Vật liệu
3.2.1. Nguồn gốc mẫu
Bảng 3.1: Danh sách các giống Cayenne đƣợc sử dụng trong đề tài
STT
Tên dòng
Nguồn gốc
Cơ quan
cung cấp
STT
Tên dòng
Nguồn gốc
Cơ quan
cung cấp
1
OMK5
Nhật
Long Định
26
OMK47
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
2

VLĐBSCL
6
OMK2
Đài Loan-BL
Long Định
31
OMK61
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
7
OMK7
MontiqueI (Pháp)
Long Định
32
OMK66
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
8
OMK15
Thơm Phụng
Long Định
33
OMK67
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
9
OMK29
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
34

Long Định
38
OMK73
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
14
OMK1
Đài Loan
Long Định
39
OMK74
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
15
OMK8
Thơm Lâm Đồng
Long Định
40
OMK75
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
16
OMK9
Thái Lan-MC
Long Định
41
OMK56
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
17

Long Định
21
OMK48
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
46
OMK62
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
22
OMK42
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
47
OMK63
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
23
OMK43
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
48
OMK68
Thơm Hà Nội
VLĐBSCL
24
OMK45
Thơm Bến Tre
VLĐBSCL
49

C
- Cân, máy đo pH

3.2.2.1. Dụng cụ và hóa chất ly trích DNA
- Đĩa nghiền: phá vỡ màng tế bào, tube 1,5 ml, micropipet: 1 µl – 1000 µl
- Máy li tâm (Biofuge pico - Heraeus)
- Chloroform : iso amylalcohol (24:1) (Đức)
- Isopropanol (Đức)
- Ethanol 100 % và 70 % (Đức)
- Dung dịch đệm ly trích DNA
Bảng 3.2: Thành phần dung dịch đệm ly trích DNA
Thành phần
Nồng độ stock
Nồng độ cuối
Thể tích
Tris (pH8.0)
1 M
100 mM
5 ml
EDTA
0,5 M
20 mM
2 ml
NaCl
5 M
500 mM
5 ml
Nuớc cất
0,5 mM
O,1ml
Nước cất 49,4ml
Tổng cộng 50,0ml

3.2.2.2. Dụng cụ và hóa chất để thực hiện điện di trên gel agarose
- Máy điện di loại nằm ngang (Gibco BRL model 4001 - Life technologies)
- Máy chụp hình gel bằng tia UV
- Agarose (Mỹ)
- Dung dịch TAE 50X
Bảng 3.4: Thành phần dung dịch TAE 50X
Thành phần
Thể tích 1 lít
Tris base 2M
242 g
Glacial acetic acid
57,1 ml
EDTA 0,5 M, pH 8.0
100 ml

- Ethidium bromide
- DNA ladder làm thang chuẩn
- DNA loading buffer


Nồng độ cuối
Thể tích
Tris (pH 8.3)
1 M
200 mM
1,0 ml
KCl
1 M
500 mM
2,5 ml
MgCl
2

150 mM
15 mM
0,5 ml
Gelatin

0,01 %
0,5 ml
Nước cất 1,0 ml
Tổng cộng 5,0 ml

- Primer: 13 primer được sử dụng để khảo sát tính đa dạng di truyền của dứa có

matrix), sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan được xây dựng theo phương pháp
UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic average), một trong những
mô hình phân tích nhóm SAHN (sequential, agglom-erative, hierarchic, non-
overlapping) (Sneath và Sokal, 1973).

3.3.2. Đánh giá kiểu gen
3.3.2.1. Tách chiết DNA
DNA của dứa được tách chiết theo quy trình CTAB (Cetultrimethylammonium
bromide) cải tiến (Nguyễn Thị Lang, 2002). Phương pháp này đặc biệt ổn định cho ly
trích DNA từ mô thực vật giàu polysaccharide (Sun và ctv, 1994), cho DNA chất

26
lượng cao, tốn nhiều thời gian nhưng rẻ tiền hơn so với nhiều phương pháp khác
(Henry T Nguyen, 1998). Quy trình gồm những bước sau:
- Bước 1: Chọn và thu mẫu lá dứa (50 mẫu), chọn lá khỏe, non (2 cm) đặt vào ống
tube và ghi nhãn cẩn thận. Ống tube chứa mẫu được giữ trong thùng đá lạnh.
- Bước 2: Lá sẽ được rửa sạch, cắt nhỏ và đặt vào đĩa (spot test plate).
- Bước 3:Thêm vào đĩa 660 µl dung dịch đệm ly trích DNA (DNA extraction
buffer) (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM EDTA, 500 mM NaCl ). Nghiền các mô lá
với chài (dụng cụ này phải được khử trùng bằng cồn và lau sạch trước khi sử dụng).
- Bước 4: Tiếp tục nghiền đến khi dung dịch có màu xanh đó là dấu hiệu tế bào bị
phá vỡ và phóng thích diệp lục. Dung dịch nghiền xong phải đặt vào đá khoảng 30
phút.
- Bước 5: Thêm vào 660 l dung dịch tách chiết, trộn đều và chuyển 660 l dịch
nghiền vào một tube sạch với thể tích là 1,5 – 2 ml đã được ghi nhãn cẩn thận.
- Bước 6: Thêm 40 l SDS 20 % trộn đều và khéo léo, sau đó ủ trong water bath
và lắc đều 10 phút ở nhiệt độ 65
0
C.
- Bước 7: Thêm vào dung dịch 100 l NaCl 5M và trộn thật kỹ. Thêm tiếp 100 l

- Sau khi gel cứng, di chuyển lược ra khỏi gel và đặt khai vào bể điện di chứa TAE
1X sau cho gel ngập trong dung dịch. Chú ý nhẹ tay tránh bọt khí.
 Tiến hành chạy điện di
- Lấy một mẫu giấy parafilm, nhỏ những giọt loading buffer lên (mỗi giọt có thể
tích khoảng 2 l). Cho thêm 10 l DNA lên mỗi giọt loading buffer và trộn đều. Dùng
pipetman hút hỗn hợp DNA cho vào giếng của khai điện di.
- Đậy nắp gel và cho chạy điện di, dòng điện cung cấp: 100 vol, 100 mA, định thời
gian cho gel chạy (tùy vào sự duy chuyển của băng).
- Tắt điện, đem gel nhuộm Ethidium bromide và mang gel đi chụp ảnh với tia UV.
Chú ý thao tác này phải thật cẩn thận bởi hoá chất nhuộm rất độc, dễ gây ung thư.

3.3.2.3. Tiến hành PCR cho phản ứng RAPD
 Trộn dung dịch PCR
Cho các thành phần dung dịch sau vào các tube PCR đã được đánh mã số:
- DNA 1,0 l (tuỳ thuộc vào nồng độ DNA).
- Dung dịch đệm PCR 10X 2,0 l.
- dNTP 2,0 l.
- Primer cần sử dụng trong mỗi phản ứng 1,0 l.
- Taq polymerase 0,5 l.
- Thêm nước cất 2 lần cho đủ 20,0 l.
Trộn đều, thêm giọt dầu (mineral oil) để tránh bay hơi, đậy nắp tube lại và cho vào
máy PCR đã cài sẳn chu trình nhiệt.
28
Bảng 3.7: Thành phần hỗn hợp dung dịch chạy PCR
Thành phần
Nồng độ
Nồng độ sau cùng

20,0

 Chạy chương trình PCR
Sau khi lấy đủ các thành phần vào tube PCR, ta tiến hành chạy phản ứng với
các bước tiến hành (Nguyễn Thị Lang, 2002) như sau:
- Bước 1: Làm biến tính DNA ban đầu ở 94
0
C trong 5 phút.
- Bước 2: Biến tính DNA tiếp theo ở 94
0
C trong 30 giây
- Bước 3: Tiến hành lai primer và DNA ở 37
0
C trong 30 giây
- Bước 4: Tổng hợp ở 72
0
C trong 1 phút.
- Bước 5: Lặp lại bước 2 - 4 trong 36 lần.
- Bước 6: Tổng hợp lần cuối ở 72
0
C trong 5 phút.
- Bước 7: Giữ lạnh ở 4
0
C.
Bảng 3.8: Chƣơng trình chạy PCR cho RAPD marker
Chƣơng
trình
Kiểu
Giai đoạn1
Giai đoạn 2


94
0
C
30 giây
37
0
C
30 giây
72
0
C
1 phút
35-36
3

72
0
C
5 phút

1
4

4
0
C

xy
=2 xy / x + y
- Xy: số băng giữa hai mẫu.
- X: số băng của mẫu x.
- Y: Số băng của mẫu y.
- Sxy: Hệ số tương đồng giữa 2 mẫu x và y.
Từ S
xy
ta tính được khoảng cách di truyền giữa x và y
D
xy
= 1 - S
xy

Trên cơ sở toán học này, các nhà toán học đã xây dựng các phần mềm
WINDIST và NTSYS cho máy tính. Chương trình WINDIST tạo ra ma trận tương
đồng từ bộ dữ liệu nhập sẵn. Chương trình NTSYS version 2.1 tạo ra sơ đồ hình cây
phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu (Kangle Zheng và ctv,

30
1995). Hiện nay 2 chương trình WINDIST và NTSYS được gộp lại thành chương trình
package-NTSYS để tiện dụng hơn.
 Cách nhập số liệu
Dữ liệu thu được từ sản phẩm PCR sẽ nhập vào excell theo những qui định
chung. Nếu như sản phẩm có băng hiện diện thì ta sẽ nhập là 1 và 0 nếu không hiện
diện băng. Sau khi nhập số liệu, ở hàng đầu tiên chúng ta ký hiệu là 1 (đối với ma trận
hình chữ nhật), cột thứ hai ghi số hàng, cột thứ ba ghi số cột, và cột thứ tư ghi số 0 nếu
không có số liệu thiếu. Sau đó, bản số liệu trong excell sẽ được dùng để xây dựng ma
trận tương đồng trong phần mềm NTSYS-pc version 2.1.