1
PHẦN I: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay dứa là một trong 3 loại cây ăn quả hàng đầu của nước ta (chuối, dứa,
cam quýt), chiếm vị trí quan trọng trong nền sản xuất rau quả. Cây dứa với ưu thế
chống chịu được đều kiện ngoại cảnh, phẩm chất cao, sớm thu hồi vốn nên đang là
một trong những chiến lược nhằm nâng cao đời sống cho người lao động và nền kinh
tế xã hội. Với tiềm năng kinh tế cao, diện tích dứa đang được mở rộng trên phạm vi cả
nước (36.541 ha năm 2002) (Tuấn và Tiến, 2002) nhằm tăng sản lượng cho tiêu dùng
và nguyên liệu cho các nhà máy chế biến ở các tỉnh như: Tiền Giang, Kiên Giang,
Long An, Hậu Giang, Thành Phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai.. Trước đây, dứa Queen
được trồng phổ biến ở nước ta nhưng có nhiều nhược điểm không phù hợp với công
nghệ cơ giới và tỉ lệ thành phần trong chế biến thấp. Chính vì thế, dứa Cayenne đang
là giống được quan tâm với nhiều đặc điểm tốt và diện tích trồng đạt 3600 ha năm
2002 ở các tỉnh phía Bắc và Đông Nam Bộ (Tuấn và Tiến, 2002). Tuy nhiên, diện tích
trồng mới nguồn vật liệu này vẫn còn thấp do nhu cầu giống chưa đủ và phần lớn
giống là nhập ngoại. Vì vậy, trước hết cần phải tìm hiểu tính đa dạng di truyền của
giống dứa Cayenne, trên cơ sở đó để thực hiện có hiệu quả việc nhân và tạo giống
đồng thời xây dựng các định hướng về kiểm tra, quản lý và bảo vệ nguồn gen các
giống cây trồng sẵn có trong nước cũng như du nhập từ nước ngoài.
Do đó, chúng tôi đã tiến hành đề tài “nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa
Cayenne bằng phƣơng pháp marker phân tử”.
Để nghiên cứu đa dạng di truyền người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp
khác nhau: phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chỉ thị
(marker) DNA (RFLP, RAPD, AFLP, SSR..). Tuỳ vào đối tượng, điều kiện và mục
đích nghiên cứu mà người ta lựa chọn phương pháp phù hợp nhất. Trong đề tài này
chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính đa dạng về di truyền của dứa Cayenne bằng
marker RAPD.
Hy vọng kết quả của đề tài này sẽ đóng góp một phần nhất định vào tiền đề của
- Đa dạng sinh học ở cấp độ loài bao gồm toàn bộ các sinh vật sống trên trái đất, từ
vi khuẩn đến các loài thực vật, động vật và các loài nấm.
- Đa dạng sinh học ở mức độ gen là sự khác biệt gen giữa các loài, giữa các quần
thể sống cách ly về địa lý cũng như các cá thể cùng chung sống trong một quần thể.
- Đa dạng sinh học còn bao gồm sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đó các
loài sinh sống và các hệ sinh thái, nơi mà các loài cũng như các quần xã sinh vật tồn
tại và cả sự khác biệt của mối tương quan giữa chúng với nhau (Phạm Bình Quyền,
2002).
- Ngoài ra đa dạng sinh học còn liên quan đến việc phân bố địa lý. Đây là sự phân
biệt có tầm rộng và là chiến lược nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới .
2.1.2. Đa dạng di truyền
Các cá thể trong một quần thể thường có genome khác nhau. Sự đa dạng về
genome được biểu hiện qua sự khác nhau về gen giữa các cá thể. Những alen khác
nhau của cùng một gen có thể làm cho sự phát triển các đặc điểm sinh lý ở mỗi cá thể
khác nhau là khác nhau. Những cây trồng được trồng lai ghép hay những động vật
được lai tạo từ những genome khác nhau có thể tạo ra những giống cây trồng, vật nuôi
cho năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt (Richard B. Primack, 1999).
Trong quá trình sinh sản hữu tính, kiểu gen của các cá thể trong quần thể sẽ
tăng lên do kết quả tái tổ hợp do đột biến.
4
Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong
quần thể. Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể
này thích nghi hơn với những thay đổi môi trường (Richard B. Primack, 1999).
2.1.3. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền
Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên
và nó cũng quan trọng đối với con người.
Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng
mg, vitamin C - 4,2 mg / 100 g
- Các chất khoáng: Ca - 16 mg, P - 11 mg, Fe - 0,3mg, Cu - 0,07 mg
- Protein - 0,4 g và lipit - 0,2 g
- Hydratcacbon - 13,7 g, nước 85,5 g và xenlulose - 1,4 g
Ngoài ra trong quả dứa còn có men bromelin giúp cho việc tiêu hoá rất tốt. Nó
được dùng trong công nghiệp thực phẩm, thuộc da, vật liệu làm phim...
Về hiệu quả kinh tế: Cayenne cho quả to, sản lượng cao, có thể đạt trên diện
tích lớn ở HaWaii 80 – 100 tấn / ha. Aubert cho rằng sản lượng Cayenne có thể gấp
đôi dứa Queen. Đồng thời, ưu điểm lớn của Cayenne là vỏ mỏng, nước nhiều, quả hình
ống, là loại hình lý tưởng để chế biến đồ hộp, dù là dứa khoanh hay nước dứa.Về mặt
canh tác, nhờ quả không có gai nên thao tác thuận lợi, hiệu suất lao động tăng lên
nhiều. Hiện nay ngành nông nghiệp nước ta đang có kế hoạch phát triển và mở rộng
diện tích dứa nhằm tăng sản lượng cho các nhà máy chế biến (Vũ Công Hậu, 1999).
2.2.3. Đặc điểm hình thái của dứa Cayenne
Dứa là một loại cây thảo lâu năm: sau khi thu hoạch quả các mầm nách ở thân
tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước, cũng cho một quả;
quả thứ hai thường bé hơn quả trước. Các mầm nách của cây con lại cho phát triển và
cho một quả thứ ba.
Cây dứa trưởng thành cao 1,0 - 1,2 m và có hình dạng như một con cù (cù- thứ
đồ chơi của trẻ em) có đường kính khoảng từ 1,3 - 1,5 m, có đáy bẹt, tán cây xoè rộng.
Cấu tạo của dứa (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2002) gồm có các thành phần sau:
6
2.2.3.1. Rễ
Rễ thường là bất định và mọc ngang mặt đất. Dựa vào nguồn gốc phát sinh chia
thành các dạng: rễ cái, rễ nhánh và rễ bất định. Rễ dứa thuộc loại ăn nông, phần lớn do
C trở lên, nếu dưới 5
0
C thì ở đỉnh
thân và gốc lá bị những vết cháy do rét. Nếu vừa lạnh vừa mưa kéo dài thì đỉnh thân sẽ
bị thối. Trường hợp ngập nước thì cả rễ và thân đều bị thối.
7
2.2.3.3. Lá
Lá mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuống, hẹp
ngang và dài. Mặt lá và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác
dụng làm giảm độ bốc hơi nước cho lá. Hình dạng lá không có gai, trừ một vài cái gai
ở ngọn, màu xanh thẩm với đốm nâu đỏ, lá dài từ 80 – 100 cm, rộng 5 – 8 cm, khi
trưởng thành có khoảng 60 - 80 lá. Hình dạng lá thay đổi tuỳ theo vị trí, tuổi của chúng
từ đó dẫn đến việc sắp xếp chúng thành nhiều loại khác nhau. Diện tích lá lớn thì quả
thường to và ngược lại cho nên cần phải tìm cách tác động cho cây đạt được số lá tối
đa. Nhiệt độ giới hạn của dứa là 5 - 40
0
C. Trên 40
0
C cây ngừng hoạt động, ở 8
0
C cây
cũng ngừng ra lá, 5
0
C các hoạt động ngừng và dưới 0
0
C cây chết rét. Sinh trưởng của
lá còn bị ảnh hưởng bởi độ phì của đất. Bón phân bổ sung một cách hợp lý làm cho
phân biệt thành 3 dạng:
- Lá chỉ có gai ở ngọn, đặc trưng cho Smooth Cayenne.
- Lá hoàn toàn có gai, trường hợp xuất hiện hầu hết ở các loài.
- Lá hoàn toàn không gai hay còn gọi với tên lá viền.
Tính trạng chỉ có gai ở ngọn và gai là những đôi tính trạng trong đó chỉ có gai ở
ngọn là tính trạng trội (S) và có gai là tính trạng lặn (s). Đều này chứng minh rằng
Cayenne là dị hợp tử và tất cả các loại có gai là đồng hợp tử với tính (s). Mặt khác,
tính trạng lá viền hay không viền là cặp tính trạng độc lập (P) và cân đối hơn với tính
trạng (S) (s). Đồng thời Collins đã chứng minh sự tồn tại của những gen khác, tất cả
những gen này hình như là những đôi tính trạng đối với gen „có gai‟.
Số lượng trung bình của chồi cuống trên một cây cũng là một đặc trưng di
truyền nhưng lại ảnh hưởng ngoại cảnh và sự phát triển sinh trưởng của dứa khi phân
hoá hoa tự. Đây là một đặc trưng quan trọng cần theo dõi bởi nó là vật liệu tốt để trồng
sau này và dễ xảy ra nhiều biến dị trong quá trình phát triển.
Một số biến dị di truyền thường xảy ra ở dứa ảnh hưởng về phương diện kinh tế
như: biến dị kéo dài ở quả, với hình dạng dài ra và đường kính bé; biến dị “quả khô”
tất cả bộ phận hoa đều không đậu, trừ các lá bắc, và trở thành biến dị “cổ chai” khi cho
các bộ phận hoa ở phần trên hoa tự không đậu; hay là những biến dị biểu hiện bằng
những lá sinh sôi nảy nở quanh các mắt hay tại mắt (Claude Py và m.A.tisseau, 1993).
2.2.5. Tình hình sản xuất và tiêu thụ trong nƣớc và thế giới
2.2.5.1. Thế giới
Theo số liệu thống kê (Anon., 2002) thu thập từ FAO (Food and Agriculture
Organisation) của Hoa Kỳ, sản lượng dứa thế giới 1999 - 2001 là 13.527.149 triệu tấn
và ước tính sẽ ổn định trong 3 năm. Sản lượng trên thế giới đã tăng gấp 3 lần trong 30
năm qua (3.833.137 năm 1961 đến 13.738.735 năm 2001). Những nước đứng đầu về
sản lượng năm 2001 bao gồm Thái Lan (2.300.000 tấn), Philippine (1.571.904 tấn),
9
Brazil (1.442.300 tấn), Trung Quốc (1.284.000 tấn).. Những nước chiếm ưu thế về thị
trên nhiều đối tượng khác nhau. Trong đó, có nhiều thành công trên thực vật như: ở
10
dứa, Duval và d‟Eeckenbrugge., (1993) đã phân tích 5 nhóm dứa trồng với 18 tính
trạng chất lượng và 27 tính trạng số lượng bao gồm đặc tính thực vật, hoa và trái. Kết
quả đã cho thấy sự tương đồng giữa các giống Cayenne, Queen và Pernambuco, trong
khi Mordilona và Spanish nằm trong nhóm khác.
Ngoài ra ở lúa, Kato và cs., (1928, 1930) bằng chỉ thị hình thái đã chia lúa trồng
thành 2 loài phụ Indica và Japonica. Sau này cũng bằng chỉ thị hình thái Morinaga
(1954) chia thêm một loài phụ thứ 3, Javanica.
Mặc dù chỉ thị hình thái rất tiện lợi, dễ xác định do đo trực tiếp trên kiểu hình
nhưng chúng lại có những hạn chế nhất định: ảnh hưởng rất nhiều do tương tác kiểu
gen với môi trường, số lượng marker có giới hạn chỉ ở qui mô hình thái và chỉ thể hiện
ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể (Bùi Chí Bửu và Nguyễn
Thị Lang, 2004).
2.3.2. Phƣơng pháp sử dụng các chỉ thị izozyme
Isoenzyme hay isozyme là một nhóm enzyme xúc tác cùng một phản ứng,
nhưng bị ức chế bởi những phân tử khác nhau do đó có nhiều dạng và hiệu quả xúc tác
khác nhau.
Isozyme có bản chất protein và là chất đa điện ly, nên trong dung dịch nó ở
trạng thái phân cực. Dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử protein khác
nhau về kích thước, trọng lượng phân tử, lực tích điện..sẽ chuyển động với tốc độ khác
nhau và sẽ phân bố ở vị trí khác nhau trên gel sau khi điện di. Các phân tử protein
enzyme là do gen quy định. Trong quá trình tiến hoá, dưới tác động của môi trường
bên ngoài và bên trong cơ thể, các gen biến đổi hình thành các allen khác nhau và nó
mã hoá cho quá trình tổng hợp các phân tử protein khác nhau về trong lượng, kích
thước, lực tích điện..Vì vậy, dùng phương pháp điện di có thể tách được các loại
protein khác nhau. Trong nghiên cứu đa dạng di truyền sự khác nhau của các protein
phản ánh sự khác nhau về đặc điểm di truyền giữa các cá thể. Chính vì vậy isozyme
- Chỉ thị trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai DNA (DNA / DNA hydridization-
based): RFLP, minisatellite.
12
Bảng 2.1: Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)
Chỉ thị (marker) Tên đầy đủ
RAPD Random amplified polymorphic DNA
AP-PCR Arbitrary primer-PCR
DAF DNA amplification fingerprinting
AFLP Amplified fragment length polymorphism
ALP Amplicon length polymorphism
SSR Simple sequence repeat (microsatellite)
SSCP Single strand conformation polymorphism
RFLP Restriction fragment length polymorphism
STS Sequence-tagged sites
Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một chiến lược được thế giới ủng hộ từ năm
1995, là phương pháp tác động mạnh đến hiệu quả chọn giống với các marker có kết
quả kỹ thuật cao trên cơ sở PCR để đánh giá kiểu gen của tính trạng mục tiêu. Sau khi
đánh giá kiểu gen chúng ta so sánh với đánh giá kiểu hình để tìm ra mức độ chính xác
của phương pháp (Bùi Chí Bửu, 2002).
2.3.3.1. Chỉ thị RFLP (RFLP marker)
Phương pháp RFLP (Retriction fragment length polymorphism) - đa hình chiều
dài các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi enzyme giới hạn, do Botstein và ctv phát minh
2.3.3.2. Nguyên tắc cơ bản và ứng dụng PCR
Phản ứng chuỗi polymerase thường được viết tắt là PCR (polymerase chain
reaction). Đây là một kỹ thuật ra đời từ đầu thập niên 1990 cho phép chúng ta ứng
dụng chỉ thị phân tử theo hướng đơn giản và hiệu quả hơn. Phương pháp PCR tạo nên
ALP ( amplicon length polymorphism) phản ánh DNA có tính đa hình giữa các cá thể,
các dòng lai và các giống trên cơ sở điện di. Ưu điểm của ALP so với RFLP là kết quả
nhanh, không đòi hỏi sử dụng đồng vị phóng xạ, giá thành thấp, số lượng DNA ít. Tuy
nhiên, khuyết điểm của phương pháp này đòi hỏi phải tổng hợp primer và Taq
polymerase.
Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase để khuếch đại
một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotid (primer) tương hợp với hai đầu 3‟ ở
14
cả hai mạch của DNA mục tiêu (target sequence). Để primer được gắn vào DNA mục
tiêu, trước tiên hai mạch của chuỗi xoắn kép phải được tách ra nhờ nhiệt độ cao, sau
đó nhiệt độ giảm xuống để cho primer liên kết vào các mạch DNA mục tiêu theo
nguyên tắc bổ sung, cuối cùng phản ứng polymer hoá được thực hiện nhờ DNA
polymerase để kéo dài mạch bổ sung ra. Đó là một chu kỳ của PCR. Do các sản phẩm
mới được tổng hợp lại được dùng làm khuôn cho primer khác, nên sau mỗi chu kỳ số
bản sao của DNA lại được tăng gấp đôi so với chu kỳ trước đó. Chu kỳ gồm ba bước
như trên được lập lại nhiều lần và tạo ra hàng triệu DNA trong vài giờ (Khuất Hữu
Thành, 2003).
Quy trình chuẩn của PCR được tiến hành như sau:
- Bước 1:Giai đoạn biến tính (Denaturation) thường là 94
0
C - 96
0
C trong vòng 30
giây -1phút (tuỳ thuộc vào vật liệu)
- Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (Annealing) thường nhiệt độ dao động khoảng 40 -
aquticus, có tính ổn định nhiệt rất cao. Trong hầu hết các protocol, người ta khuyến
cáo nồng độ Taq sử dụng là 0,5 U / 25 µl. Nếu nồng độ Taq quá cao (> 1,25 U / 25 µl,
15
những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ
Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lượng men xúc tác tạo ra sản phẩm PCR
mong muốn (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang, 2004).
- Primer và dNTP
Dung dịch dNTP làm stock phải được trung tính ở pH=7.0 và tồn trữ ở -20
0
C.
Stock được dùng nên có nồng độ dNTP là 1mM. Sự ổn định của dNTP trong suốt các
chu kỳ lập lại ước còn khoảng 50 % sau 50 chu kỳ (Innis và ctv, 1990). Hàm lượng
dNTP trong khoảng 20 – 200 µM cho kết quả ổn định, trung thực và chuyên tính. Bốn
dNTP được xử lý sao cho nồng độ chúng tương đương nhau, để giảm thiểu tối đa hiện
tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào đó.
Sự khuếch đại chuyên biệt đối với DNA cần nghiên cứu, đều phải tuỳ thuộc các
primer tương xứng. Do vậy, chiều dài primer và thành phần G+C đều có ảnh hưởng
quan trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động ở đầu dây đơn. Nếu có 50 % G+C,
thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18 - 20 nucleotide và có tính
đặc hiệu hơn, còn đối với primer chứa một đoạn lớn hơn 4 nucleotide liên tục thì nó sẽ
làm mất tính đặc hiệu.
- DNA mục tiêu
Người ta cần phải có những đoạn DNA mang mật mã biết trước, được gọi với
thuật ngữ “ target DNA” (DNA mục tiêu) trong kỹ thuật PCR. Kết quả thu nhận sẽ tốt
nhất, nếu DNA thật sự thuần khiết, DNA từ các mô lá. Số lượng DNA cần cho một
phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5 – 10 ng DNA thuần khiết, đối với RAPD thì
lượng này là 5 – 25 ng DNA.
Chỉ thị RAPD (RAPD marker)
Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể tiến hành với các
bước như sau:
- Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR.
- Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.
- Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-pc,
UPGMA cluster.)., lập dendrogam. Các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách
biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.
Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và nguồn gốc di
truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng được sử dụng
cho những mục đích sau:
17
- Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó như
tính trạng chất lượng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua (Tatieni et al.,
1996; Winter et al., 1995).
- Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể.
- In dấu vân tay (DNA fingerprinting).
- Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal variation).
Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng chỉ thị RAPD
cũng có một số hạn chế như sau:
- Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể dị
hợp tử
- Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất
- Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu.
- Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân.
Hình 2.1: Nguyên lý phân tích chỉ thị RAPD trong nghiên cứu
sự đa dạng di truyền.
Marker AFLP
cao và có khả năng tự động hoá trong quá trình thực nghiệm. Tuy nhược điểm của chỉ
thị này là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một loài.
Nhưng marker SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu
di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền. Chẳng hạn, Parasnis (1998) phát
hiện đoạn lập lại GATA kích thước 5 kb chỉ có ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ
cái bằng marker SSR. Ngoài ra, microsattelitte marker cũng được dùng để phân tích
tính đa dạng nguồn gen cây có múi (Trần thị Oanh Yến và ctv, 2003).
19
2.4. Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di
truyền trên Thế Giới và Việt Nam
2.4.1. Nghiên cứu trên Thế Giới
Hiện nay, nhu cầu sản lượng dứa trên thế giới dùng cho chế biến ngày càng
tăng đòi hỏi các nhà chọn giống phải tạo ra những giống có chất lượng phù hợp với
nhu cầu thị trường. Vì thế, nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trên dứa đã được
thực hiện và thành công với sự đóng góp của các loại chỉ thị phân tử nhằm cung cấp
những thông tin về di truyền để chọn giống chính xác hơn. Những thành công được thể
hiện qua những nghiên cứu sau:
- Nghiên cứu sự đa dạng di truyền dứa bằng marker AFLP ( Cecilia Y. Kato và ctv,
1992). Sự đa dạng di truyền được tiến hành trên 70 giống dứa (Ananas comosus L) và
3 họ có liên quan (Ananas ananassoidies, Ananas bracteatus và Ananas erctifolius).
Kết quả cho thấy việc lai khác loài giữa A. comonus và A. ananassoidies với mức
tương quan của A. comonus (0.398) và A.ananassoidies (0.381). Qua đó cho thấy sự
khác biệt di truyền trong số các giống dứa phần lớn có thể do đột biến.
- Phân tích đa dạng di truyền phân tử dứa bằng marker RFLP (Duval và ctv, 2001)
đã cho thấy được sự giống nhau giữa Ananas comosus và Pseudananas comosus là
58,7% qua sử dụng 18 probe tương đồng để lai.
- Xác định đặc tính của phôi dứa (Ananas spp) bằng marker AFLP: 40 giống
- Phân biệt các giống và phân tích nhóm / loài thuộc chi Citrus ở Việt Nam bằng
chỉ thị RAPD (Nguyễn Thanh Nhàn và ctv, 2003).
- Phân tích sự đa dạng di truyền của giống đậu nành bằng marker phân tử (Phạm
Thị Bé Tư, Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2003). Kết quả 50 giống đậu nành đã
được phân thành 5 nhóm chính thông qua 17 primer và phân tích dựa trên UPGMA .
- Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây lúa
(Bùi chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999; Nguyễn Đức thành và ctv, 1999).
- Nghiên cứu sự đa hình di truyền của một số dòng, giống lúa phục vụ công tác
chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử (Đỗ Đức Tuyến, 2000).
- Nghiên cứu tính đa dạng di truyền trên 17 giống dưa leo dựa vào kỹ thuật RAPD
(Phan Lê Diệu Phương, 2003).
21
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện từ ngày 1 tháng 3 năm 2005 đến ngày 1tháng 8 năm 2005
tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử thuộc Bộ Môn Di truyền và Chọn giống ở
Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Ô Môn, TP. Cần Thơ.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Nguồn gốc mẫu
Bảng 3.1: Danh sách các giống Cayenne đƣợc sử dụng trong đề tài
STT Tên dòng Nguồn gốc Cơ quan
22
Mẫu dùng để nghiên cứu trong đề tài này gồm 50 dòng dứa từ giống Cayenne
trong đó có một số ít dòng dứa thuộc giống Queen để làm đối chứng. Những dòng dứa
này được thu thập từ nhiều vùng khác nhau và trồng tại Viện Lúa Đồng Bằng Sông
Cửu Long, Ô Môn , TP Cần Thơ. Danh sách được trình bày ở bảng 3.1.
Trong tập đoàn dứa khảo sát thì các dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội được xử
lý đồng loạt và đem ra trồng từ dạng nuôi cấy mô, các dòng dứa còn lại được trồng ở
dạng hom có chiều dài khoảng 15 cm.
3.2.2. Dụng cụ và hóa chất
- Máy thanh trùng (autoclave), máy Waterbath, lò vi sóng
- Tủ lạnh 4
0
C và - 20
0
C
- Tủ sấy 37
0
C
- Cân, máy đo pH
3.2.2.1. Dụng cụ và hóa chất ly trích DNA
- Đĩa nghiền: phá vỡ màng tế bào, tube 1,5 ml, micropipet: 1 µl – 1000 µl
- Máy li tâm (Biofuge pico - Heraeus)
- Chloroform : iso amylalcohol (24:1) (Đức)
- Isopropanol (Đức)
- Ethanol 100 % và 70 % (Đức)
- Dung dịch đệm ly trích DNA
Bảng 3.2: Thành phần dung dịch đệm ly trích DNA
Thành phần Nồng độ stock Nồng độ cuối Thể tích
- Dung dịch TAE 50X
Bảng 3.4: Thành phần dung dịch TAE 50X
Thành phần Thể tích 1 lít
Tris base 2M 242 g
Glacial acetic acid 57,1 ml
EDTA 0,5 M, pH 8.0 100 ml
- Ethidium bromide
- DNA ladder làm thang chuẩn
- DNA loading buffer
24
Bảng 3.5: Thành phần dung dịch loading buffer
Thành phần Thể tích
Tris 1 M (pH=8.0) 0,5 M
Glycerol 5,0 ml
EDTA 0,5 M (pH=8.0)
100 l
Xylen Cyanol 0,2 % 15 mg
Bromophenol blue 0,2 % 15 mg
Nước cất 4,5 ml
Tổng cộng 50 ml
3.2.2.3. Dụng cụ và hóa chất để thực hiện phản ứng chuỗi PCR
- Máy thermal cycler (Biorad)
- Mẫu DNA ly trích
- Dung dịch stock của dNTPs (5 mM).
lá.
- Số lá: thiết lập đo và điếm từng lá trên một cây.
- Ngày trổ hoa: tính từ ngày trồng cho đến khi cây có hoa và nhú trái.
- Trọng lượng trái (kg) đo lúc trái được thu hoạch.
- Quan sát hình dạng lá có gai, không gai hay lá viền (chỉ có gai một phần hoặc ở
một số vị trí trên lá như ngọn, gốc hoặc giữa lá) và màu sắc lá ghi nhận ở những mức
độ màu khác nhau.
Phân tích số liệu thu thập thông qua phần mềm IRRISTAT vesion 3.0 và sau đó
phân tích nhóm dựa vào chương trình NTSYS (Numercial Taxonomy System) version
2.1. Để phân tích nhóm dựa vào số liệu (numercial classficatory analysis), ta sử dụng
hệ số CORR (Pearson product-moment correlation coefficient) như là đơn vị để tính
sự tương quan giữa các dòng dứa dựa vào tính trạng hình thái và giá trị CORR được
tính toán theo Sneath và Sokal (1973). Dựa trên ma trận tương quan (Correlation
matrix), sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan được xây dựng theo phương pháp
UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic average), một trong những
mô hình phân tích nhóm SAHN (sequential, agglom-erative, hierarchic, non-
overlapping) (Sneath và Sokal, 1973).
3.3.2. Đánh giá kiểu gen
3.3.2.1. Tách chiết DNA
DNA của dứa được tách chiết theo quy trình CTAB (Cetultrimethylammonium
bromide) cải tiến (Nguyễn Thị Lang, 2002). Phương pháp này đặc biệt ổn định cho ly
trích DNA từ mô thực vật giàu polysaccharide (Sun và ctv, 1994), cho DNA chất
Copyright: Tài liệu đại học ©