11
nhiên số lượng marker isozyme ít do đó không đủ để nghiên cứu toàn vẹn sự đa dạng
di truyền, phân tích dựa trên kiểu hình nên dễ bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường.
Ứng dụng của marker isozyme đã được sử dụng thành công để nhận diện giống
ở một số loài cây ăn trái như bơ ( Goldring và ctv, 1985), táo (Weeden và Lamb,
1985), xoài (Chemda Degani và Ruth EI-Batsri, 1990 - 1992). Đối với dứa, marker
isozyme cũng đã được sử dụng để phân nhóm 161 dòng dứa dựa vào 6 enzyme
(Aradhya M.K. và ctv, 1994).

2.3.3. Phƣơng pháp dùng chỉ thị (marker) phân tử
Chỉ thị phân tử là những đặc điểm thể hiện ở khía cạnh hoá học hay cấu trúc
phân tử di truyền lại cho đời sau, giống như các nhân tố di truyền Meldel, nhưng lại có
thể định lượng được. Về nguyên tắc, bất cứ đoạn DNA nào phân biệt được hai cá thể,
hai dòng hoặc các giống khác nhau thì có thể xem như là một marker DNA. Marker
DNA có nhiều ưu điểm hơn so với marker hình thái và isozyme vì sản phẩm thể hiện
tính đa hình cao, tính đồng trội, tính ổn định không phụ thuộc vào yếu tố môi trường.
Các chỉ thị di truyền phân tử được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể
trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài (thứ), phát
hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài (Ahn et al., 1993; Dunforal et al.,
1995). Chúng có thể được dùng để chọn các tổ hợp lai (Nair et al., 1995; Zhang et al.,
1995).
Các chỉ thị DNA có thể chia thành 2 nhóm sau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị
Lang, 2004):
- Chỉ thị dựa trên cơ sở chuỗi phản ứng polymerase (PCR - Polymerase Chain
Reaction) (PCR-based): có các RAPD, AFLP, SSR, SSCP, STS
- Chỉ thị trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai DNA (DNA / DNA hydridization-
based): RFLP, minisatellite.

của phương pháp (Bùi Chí Bửu, 2002).

2.3.3.1. Chỉ thị RFLP (RFLP marker)
Phương pháp RFLP (Retriction fragment length polymorphism) - đa hình chiều
dài các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi enzyme giới hạn, do Botstein và ctv phát minh
năm 1980. Nguyên lý này dựa vào các đặc tính sau:
- Tính chất đặc trưng của các enzyme giới hạn (Restriction enzyme - RE), có nghĩa
là mỗi loại enzyme giới hạn chỉ cắt ở những trình tự nucleotide nhất định của DNA
(loại enzyme 6 cắt và 4 cắt). Như vậy DNA của genome sẽ bị enzyme cắt ở những
trình tự nucleotide đặc trưng và tạo thành những đoạn có kích thước khác nhau.
- Tính chất bắt cặp tương đồng giữa các chuỗi DNA theo nguyên tắc bổ sung, có ý
nghĩa là chuỗi DNA mẫu dò sẽ bắt cặp (lai) với chuỗi có trình tự nucleotide tương
đồng với nó trên DNA genome.

13
Cụ thể nguyên lý của phương pháp này: DNA của genome sẽ được xử lý bởi
cùng enzyme giới hạn tạo ra những đoạn có kích thước khác nhau biểu hiện nhờ điện
di trên gel, qua biến tính các đoạn này trở thành những sợi đơn và được chuyển lên
màng lai cellulose hoặc nylon. Quá trình lai diễn ra giữa DNA mục tiêu với các đoạn
DNA thăm dò trên màng lai (probe) có gắn đồng vị phóng xạ. Kết quả của quá trình
này được phát hiện nhờ những chất phát quang (fluorescens). Khi phân tích đa dạng di
truyền, sự đa dạng của cá thể sẽ thể hiện qua sự khác nhau của các băng lai trên màng.
Chỉ thị RFLP đã được ứng dụng nhiều trong chọn giống và đa dạng di truyền ở
thực vật. Chẳng hạn, Takashige Ishii và cs (1995) đã phân tích sự đa dạng di truyền
của 112 giống lúa ở Châu Á qua sử dụng 12 probe DNA có kích thước từ 0,8 - 3,4 kb
liên kết với các vùng của các nhiễm sắc thể từ số 1 - 12. Tương tự, Qifa Zang và cộng
sự (1992) đã xác định được sự đa dạng di truyền giữa các giống lúa indica (12 dòng)
và japonica (14 dòng) qua sử dụng 49 probe RFLP. Ở Việt Nam, RFLP được sử dụng
trong nghiên cứu đa dạng quần thể nấm đạo ôn miền bắc và miền trung Việt Nam ( Lã
Tuấn Nghĩa và ctv, 1997) và còn được dùng trong phân tích đa hình DNA các giống

C - 96
0
C trong vòng 30
giây -1phút (tuỳ thuộc vào vật liệu)
- Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (Annealing) thường nhiệt độ dao động khoảng 40 -
72
0
C thường là 55
0
C và kéo dài từ 30 giây - 1 phút.
- Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (Extension) lúc này nhiệt độ tăng lên đến
72
0
C, đây là nhiệt độ tối ưu cho nhiều DNA polymerase chịu nhiệt (Chien và ctv,
1976) và kéo dài từ 1 phút đến nhiều phút tuỳ vào độ dài DNA cần khuếch đại.
Chu kỳ gồm 3 bước này sẽ được lập lại nhiều lần khoảng 25 - 40 (tuỳ vào ứng
dụng chuyên biệt). Cuối cùng được kết thúc bằng một “extension” ở 72
0
C trong 5
phút, sau đó cho dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở
4
0
C (tuỳ vào loại máy Thermal cycler được sử dụng) (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang,
2004).
Số bản sao DNA được tạo ra nhờ kỹ thuật PCR được tính như sau:
Tổng số khuếch đại = m x 2
n

Trong đó n là số chu kỳ, m là số copy của chuổi mã hoá cần nghiên cứu. Giả sử
chúng ta đạt hiệu quả là 100 %, sau 30 chu kỳ chúng ta sẽ có tổng số sản phẩm khuếch

nhất, nếu DNA thật sự thuần khiết, DNA từ các mô lá. Số lượng DNA cần cho một
phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5 – 10 ng DNA thuần khiết, đối với RAPD thì
lượng này là 5 – 25 ng DNA.

 Chỉ thị RAPD (RAPD marker)
Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin
về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải được biết rõ trước khi chuẩn bị các primer tương
ứng. Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một giống cây trồng
mới sẽ gặp nhiều khó khăn.
Vào đầu thập kỹ 90, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên
gọi là RAPD (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai
phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990 và Welsh et al., 1991). Kỹ thuật này cho
phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng

16
một primer chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Thường primer này chứa từ 9-12
oligonucleotit, tối thiểu là 4 bp. Có ngàn hàng loại primer chứa khoảng 10 bp nhưng số
lượng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế. Trong phản ứng này, các primer
đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn. Nếu các
điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản được (thường 200 - 2000
nucleotide) thì đoạn DNA sẽ được nhân lên. Sự có mặt của sản phẩm này được quan
sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tương
đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide. Các
primer dùng trong RAPD có kích thước ngắn nên dễ tìm được các đoạn tương đồng
trên các mạch đơn DNA trong genome. Vì thế, nó là một phương pháp có hiệu quả để
xác định tính đa hình về trật tự nucleotide giữa các cá thể. Ví dụ, tần số tìm thấy sự đa
hình RAPD là 0.3 / 1 primer ở cây Arabidopsis thaliana, là 0.5 / 1primer ở cây đậu
tương, 1 / 1 primer ở ngô (Lê Duy Thành, 2000).
Các ưu điểm chính của chỉ thị RAPD không cần biết trước trình tự nuleotide
của đoạn DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa


Hình 2.1: Nguyên lý phân tích chỉ thị RAPD trong nghiên cứu
sự đa dạng di truyền.

 Marker AFLP
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) – đa dạng chiều dài các
đoạn DNA được nhân bản chọn lọc, là phương pháp dựa trên nguyên tắc PCR. Ở đây
sản phẩm PCR là kết quả của quá trình nhân bội các đoạn DNA sau khi đã được cắt
bằng enzyme giới hạn (Zabow M. Và Vos P.,1993). Nguyên lý của kỹ thuật này như
sau: trước khi làm phản ứng PCR người ta gắn các đoạn DNA ngắn (adaptor) vào hai

18
đầu của mảnh DNA đã được cắt bằng enzyme giới hạn sau đó thiết kế các primer theo
các đoạn DNA ngắn có gắn thêm một hoặc một số nucleotide và tiến hành phản ứng
PCR. Khi thay đổi số lượng và trật tự các oligonucleotid được chọn lọc ở các đầu nối
ta có thể nhận được những đoạn DNA được nhân bản khác nhau. Sản phẩm được phân
tích trên gel polyacrymide, kết quả thu được thường là 50 - 100 băng DNA trên mẫu
thí nghiệm.
Kỹ thuật AFLP là phương pháp xác định đa hình cao, tiết kiệm thời gian, dễ
dàng lập lại và có thể sử dụng để phân tích DNA ở bất kỳ mức độ nào (Zabeau, 1993)
do đó được đánh giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng di
truyền ở cây trồng như lúa, lạc (Redona et al., 1998; He et al., 1997). Tuy nhiên,
AFLP là loại chỉ thị di truyền trội, giá thành đắt nên phần nào hạn chế sử dụng.

 Marker SSR ( Microsatellite marker)
Marker microsatellite bao gồm một chuỗi mã gốc (core sequence) được lập lại
nhiều lần, và phân tán rộng khắp trong genome, trên nhiều loci, mỗi locus chứa alen
thích ứng với mỗi dạng khác nhau về số lần lập lại của nó (core repeat), và nó rất nhạy
cảm (Ramakrishna và ctv, 1995). Được gọi với thuật ngữ chuỗi mã đơn giản lập lại
nhiều lần (Simple sequence repeats= SSR) chiều dài thường 1 – 100 bp. Do đó SSR có

khác biệt di truyền trong số các giống dứa phần lớn có thể do đột biến.
- Phân tích đa dạng di truyền phân tử dứa bằng marker RFLP (Duval và ctv, 2001)
đã cho thấy được sự giống nhau giữa Ananas comosus và Pseudananas comosus là
58,7% qua sử dụng 18 probe tương đồng để lai.
- Xác định đặc tính của phôi dứa (Ananas spp) bằng marker AFLP: 40 giống
(dòng) dứa được thu thập và xác định mức độ đa hình giữa các giống, đặc tính của
chúng. Sự phân nhóm di truyền đã chỉ rõ mối liên quan giữa các nhóm và sự khác biệt
với các loài hoang dại. Sự khác biệt này do tự bản thân giống hoặc do yếu tố môi
trường, tỉ lệ đột biến và sự khác biệt dòng soma.
- Xác định độ tin cậy kiểu gen của cây dứa vi nhân giống liên quan đến marker
isozyme và RAPD (Sergio Feuse và ctv, 2003).
- Đánh giá sự liên quan di truyền của giống dứa Ananas và Pseudananas bằng
marker RAPD (Claudete de Fátima Ruas1và ctv, 2001).
- Ngoài ra, các nghiên cứu về sử dụng RAPD trong phân tích đa dạng di truyền trên
nhiều đối tượng khác như cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, dâu tây, khoai tây, cà chua
cũng đã có nhiều báo cáo thành công.
20
2.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam
Ở nước ta, hiện nay đã có một số viện nghiên cứu và các trường đại học đã tiến
hành nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gen , sử dụng kỹ thuật RAPD,
AFLP, SSR… Tuy số lượng của các nghiên cứu này chưa nhiều nhưng đã cho thấy
chúng ta có khả năng thực hiện những nghiên cứu sử dụng công nghệ tiên tiến nhằm
đẩy mạnh công tác chọn tạo giống, vật nuôi, cây trồng. Dưới đây là một số nghiên cứu
đã ứng dụng thành công trên nhiều loại cây trồng như:
- Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống (dòng) dứa bằng chỉ thị RAPD
(Hoàng Thị Bích Thuỷ và Ctv, 2004). Kết quả nghiên cứu này đã phân nhóm được 7
giống (dòng) qua sử dụng 9 loại primer đã xác định được các quần thể Trung Quốc