21
kháng thuốc diệt cỏ (Chen và ctv., 1994; Perlak và ctv., 1990). Các loại mẫu cấy nhƣ
trụ hạ diệp, tử diệp, mô sẹo từ trụ hạ diệp và tử diệp cũng nhƣ phôi non đã đƣợc dùng
trong việc chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens hay nhờ súng bắn gen
(Firoozabady và ctv., 1987, Perlak và ctv., 1990). Gould và Cedeno (1998) đã sử dụng
đỉnh chồi làm mẫu cấy phục vụ cho việc chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Ngoài ra còn có các mô phân sinh phân lập từ trục phôi
đã đƣợc sử dụng cho việc chuyển gen bằng súng bắn gen ở bông vải (Chlan và ctv.,
1995). Chuyển gen bằng súng bắn gen đã đƣợc Finer và McMullen (1990) thực hiện
trên dịch huyền phù tế bào và kết quả là thu đƣợc cây chuyển gen. Trƣớc đó Finer và
Smith (1984) đã thực hiện nghiên cứu tạo mô sẹo và phôi soma từ mẫu cấy là thân và
cuống lá. Súng bắn gen cũng đƣợc sử dụng để chuyển gen vào các mô thu đƣợc từ việc
tái sinh phôi soma (Rajasekaran, 1996, Reichert và ctv., 2002).
Tuy nhiên tỉ lệ chuyển gen thƣờng khá thấp, biến động 20 – 30% khi trụ hạ diệp
đƣợc dùng làm mẫu cấy (Firoozabady và ctv., 1987, Rajasekaran, 1996). Một hiệu quả
chuyển gen cao hơn có ý nghĩa (đến 60%) đã đƣợc công bố khi trụ hạ diệp đƣợc dùng
làm mẫu cấy và gen onc (mã hóa cho enzyme tổng hợp octopin-octopin synthase)
đƣợc dùng làm gen chỉ thị (Firoozabady và ctv., 1987). Chaudhary và ctv. (2003) cũng
báo cáo với mẫu lây nhiễm là phôi soma sau khi thanh lọc tỉ lệ mẫu biểu hiện GUS là
75%. Nhƣng chỉ là kết quả của thử nghiệm sự biểu hiện gen tạm thời của gen onc và
gen gus. Một báo cáo gần đây cho rằng hiệu quả chuyển nạp ở song tử diệp chỉ khoảng
20-30%, hiệu quả chuyển nạp gen thậm chí còn thấp hơn khi sử dụng phƣơng pháp
bắn gen. Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố sự khác biệt giữa các loại mẫu cấy
đƣợc dùng trong chuyển nạp gen có ảnh hƣởng đến hiệu quả của chuyển nạp gen và tái
sinh cây. Ví dụ ngƣời ta cho rằng để giảm thiểu các thể chuyển nạp dƣơng tính giả, tử
diệp là mẫu cấy tốt hơn trụ hạ diệp (Firoozabady và ctv., 1987). Nghiên cứu về chuyển
nạp gen trên cây bông vải, Sunilkumar và Rathore (2001) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh
hƣởng đến hiệu quả chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Nghiên cứu này cho thấy các yếu tố nhƣ chủng vi khuẩn, acetosyringone và nhiệt độ
trong chuyển gen có ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen. Thêm vào đó kích

đƣợc gọi là phƣơng pháp chuyển nạp gen gián tiếp (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,
2000). 23
2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Chi Agrobacterium đƣợc chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây bệnh và
kí chủ. Một số loài thuộc chi Agrobacterium nhƣ: A. radiobacter (loài này không gây
bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh khối u và bệnh cổ rễ, A. rubi
gây bệnh khối u trên cây mía. Gần đây nhất một loài mới vừa đƣợc đề nghị là A. vitis,
loài này gây bệnh khối u trên cây nho và một số loài cây khác (Ophel và Kerr, 1990).

Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra. A: một
khối u lớn trên thân cây hoa Hồng, B: các khối u trên cành Nho
(Deacon và ctv., 2005).

Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di
động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium.
(Deacon và ctv., 2005). Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có
5-11 lông roi. Vi khuẩn này phát triển tối ƣu ở nhiệt độ 29
0
C trong môi trƣờng có bổ
sung một chút mangan và succinate nhƣ là nguồn cacbon duy nhất. Agrobacterium
tumefaciens là tác nhân gây bệnh cho cây bằng cách tạo khối u trên cây hai lá mầm do
nó có khả năng chuyển DNA vào tế bào cây (Hansen và Chilton, 1999, Gelvin, 2000).
Khi rễ cây xuất hiện vết thƣơng, tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thƣơng và
xâm nhập vào cây qua vết thƣơng đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid,
một trong số đó có mang gen tạo khối u và đƣợc biết đến với tên gọi là pTi. Plasmid Ti
cũng mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi
khuẩn không mang pTi đƣợc xem nhƣ là vi khuẩn không độc và không có khả năng

Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T-DNA-trình tự mã hoá đƣợc chuyển vào
trong cây, vùng vir-vùng trực tiếp tham gia tạo T-DNA sợi đơn và chuyển T-DNA này
vào tế bào cây, vùng rep-cần cho sự tái bản của pTi, vị trí tra và trb- tham gia vào quá
trình chuyển tiếp hợp của pTi, các gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các opine
(Zhu và ctv., 2000). Trong cấu trúc của pTi, hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển
gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của đoạn T- DNA
và gen Vir (Gelvin, 2003).

2.3.2.1. Chức năng của T-DNA
T-DNA đã đƣợc nghiên cứu rất kỹ. Đó là một đoạn DNA có kích thƣớc 10-30
kbp (Gelvin, 2003), trong đó có chứa gen mã hoá cho việc tổng hợp auxin, cytokinin,
opine và các gen gây khối u. Trong pTi, vị trí của T-DNA đƣợc giới hạn bởi bờ phải
và bờ trái. Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tƣơng tự nhau và đều có kích
thƣớc 25 bp (Gelvin, 2003). Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA có thể đƣợc bỏ qua trong
chuyển nạp T-DNA, trong khi đó bờ phải lại cần thiết và đƣợc đề nghị rằng tiến trình
chuyển nạp diễn ra với bờ phải trƣớc rồi tiến dần về phía trái. Việc đảo ngƣợc bờ phải
sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u (Miranda và ctv., 1992, Gelvin, 2003). Các trình tự
bờ không chỉ là mục tiêu của của VirD1/VirD2 endonuclease mà còn là vị trí gắn của
protein VirD2.
T-DNA mã hóa một vài protein, protein này biểu hiện trong tế bào cây đƣợc
chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn. Các gen trên T-DNA có thể biểu hiện
trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể đa bào. Theo Binns và
Costantino (1998), T-DNA mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của
các gen đƣợc chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây bao gồm kiểu hộp
TATA (TATA box) và hộp CAAT (CAAT box), yếu tố tăng cƣờng sao mã, các vị trí
gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào. Một nhóm các gen của T-DNA điều khiển tổng
hợp các hormon sinh trƣởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh và
làm thay đổi hình dạng bên ngoài. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự
chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin). Sản
phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và

có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine. 27
2.3.2.2. Chức năng của gen Vir
Vùng Vir trên plasmid Ti có khoảng 25 gen đƣợc nhận biết trong 7 đơn vị phiên
mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF và vùng này có kích thƣớc khoảng 30-
40 kbp (de la Riva và ctv., 1998). Theo Stachel và ctv. (1987) vùng này có 20 gen nằm
trên 6 operon, các gen đó là: virA, virB, virC, virD, virE và virG. Những gen vir này
mã hoá cho các vai trò nhƣ: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, tạo
đoạn T-DNA sợi đơn, chuyển nạp đoạn T-DNA và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm
nhập của T-DNA vào tế bào kí chủ (Gelvin, 2003).
Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thƣơng của cây thông qua dấu
hiệu hoá học tiết từ vết thƣơng. Các tín hiệu hoá học từ vết thƣơng ở tế bào cây chủ tạo
ra đƣợc nhận biết trƣớc tiên bởi protein VirA, rồi đến protein VirG để làm kích hoạt
các gen độc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết. Gen vir đƣợc kích hoạt tối đa
ở pH axit với sự hiện diện của các hợp chất phenon nhƣ là acetosyringone (AS), chất
mà đƣợc giải phóng khi tế bào cây bị tổn thƣơng (Stachel và ctv., 1987). Hệ thống điều
hoà gen vir hoạt động thông qua hai gen độc: virA và virG. Biểu hiện cơ bản của gen
virA tổng hợp nên protein nằm trong màng tế bào. Protein VirA đáp ứng với sự trao
đổi chất của vết thƣơng của cây và có thể đáp ứng nhạy cảm với sự thay đổi của môi
trƣờng. Với một nồng độ AS thích hợp VirA có thể đƣợc kích thích bởi đƣờng, các
opine khối u hoặc amino axit (Ziemienowicz, 2001). Protein VirA sẽ tự phosphoryl
hoá. Sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào VirG đƣợc phosphoryl hoá bởi
aspartic axit còn lại sau khi VirA tự phosphoryl hoá (Jin và ctv., 1990) và kích hoạt sao
mã cho tất cả các gen vir. Các promoter của gen vir có kích thƣớc khoảng 12 bp trong
trình tự “vir box” (Winans và ctv., 1987). Sự phosphoryl hoá làm cho protein VirG gắn
kết vào “vir boxes” và kích hoạt sự sao mã của các gen virBCDEFGH (Ziemienowicz,
2001).
Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn (hình 2.3)

và đƣợc cho là cung cấp năng lƣợng cho việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận
chuyển T-DNA, hoặc cả hai. Hệ thống VirB đƣa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây,
nơi đây các bƣớc cần cho chuyển T-DNA vào nhân và kết nạp với DNA của cây đƣợc
thực hiện (Zhu và ctv., 2000). Cầu nối VirB có thể gắn kết với phức hợp T-DNA bởi
protein VirD4, protein này nằm trong màng và rất cần cho việc chuyển nạp. Hệ thống
VirB/VirD4 đƣa phức hợp T-DNA–VirD2 và protein VirE2 vào tế bào chất của tế bào
cây, phức hợp T-DNA cuối cùng đƣợc tạo ra bằng cách phủ T-DNA với protein VirE2
(Ziemienowicz, 2001).
29
2.3.3.3. Cơ chế lây nhiễm
Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề
mặt rễ cây. Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử
dụng chất dinh dƣỡng do mô rễ tạo ra. Nhƣng vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây
bị tổn thƣơng do nhiều nguyên nhân. Yêu cầu về vết thƣơng cho việc xâm nhiễm có
thể dễ dàng đƣợc chứng minh bằng các thí nghiệm. Trong điều kiện tự nhiên, các tế
bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thƣơng nhờ các dấu hiệu hoá học. Điều này có
đƣợc là do đáp ứng giải phóng đƣờng và các thành phần phổ biến khác trong rễ. Tuy
nhiên, chủng vi khuẩn có mang pTi sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng xác định các
hợp chất vết thƣơng (hợp chất phenolic) nhƣ acetosyringone. Chất này có tác dụng rất
mạnh mặc dù ở nồng độ thấp (10
-7
M). Bởi vậy, một trong những chức năng của pTi là
mã hoá cho các thụ thể (receptor) nhận biết các chất hoá học. Những thụ thể này nằm
trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn
thƣơng. Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm. Ở nồng
độ cao (10
-5

đoạn tƣơng đồng với DNA của cây và gắn vào. Cả việc tách sợi DNA của cây và
overhang đầu 3’ của T-DNA đều đƣợc enzyme nuclease thực hiện. Cuối cùng
nucleotide gắn với VirD2 tìm các đoạn vi tƣơng đồng (microhomology) trên DNA cây
và gắn vào. Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’
đến gần đầu 3’ nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi
DNA của cây đƣợc hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA
dẫn đến sự kết nạp của T-DNA hoàn thành. Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành
các gen trên T-DNA hoạt động tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn
(Ziemienowicz, 2001). Các opine đƣợc tạo ra từ các khối u do vi khuẩn Agrobacterium
nhiễm vào đƣợc vi khuẩn biến dƣỡng nhờ vào các gen ở vùng phân giải opin trên pTi.
Tùy theo kiểu opine mà đƣợc chuyển hóa bởi các gen khác nhau (Ziemienowicz, 2001,
trích từ Petit và Tempé, 1985).