33
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. KẾT QUẢ
4.1.1. Định tính
Để xác định thời điểm xuất hiện và thời gian tồn tại của kháng thể trong kháng
huyết thanh (KHT) ta thực hiện phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với KHT
thu đƣợc sau khi li tâm tách huyết thanh.
4.1.1.1. Qui trình ngắn ngày (35 ngày)
Thỏ đƣợc tiêm kháng nguyên với liều tăng dần từ 0,5 ml đến 2 ml dịch vi khuẩn.
Khoảng cách giữa 2 lần tiêm là 5 ngày. Sau khi tiêm mũi nhắc lại thứ 4 tiến hành lấy
máu thu kháng thể, lấy máu 3 lần mỗi lần cách nhau 5 ngày và lần cuối cùng lấy hết
máu.
Trƣớc khi gây miễn dịch và sau mỗi lần tiêm kháng nguyên vi khuẩn 4 ngày tiến
hành lấy máu kiểm tra kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính, kết
quả đƣợc trình bày bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng
huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2
Thỏ
Lấy máu
Thỏ 1
Thỏ 2
Trƣớc khi tiêm
-
-
Sau mũi mẫn cảm
-
-

máu lần 3 (15 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần cuối – mũi 4 ).
4.1.1.2. Qui trình dài ngày (154 ngày)
Thỏ đƣợc tiêm kháng nguyên với liều từ cao xuống thấp. Khoảng cách giữa 2 lần
tiêm là 28 ngày. Kể từ khi tiêm mũi nhắc lại thứ 3 tiến hành lấy máu thu kháng thể sau
mỗi lần tiêm kháng nguyên 14 ngày.
Trƣớc khi tiêm và sau khi tiêm mũi mẫn cảm, các mũi nhắc lại 14 ngày tiến hành
lấy máu để thử phản ứng ngƣng kết xác định sự hiện diện của kháng thể trong kháng
huyết thanh. Kết quả đƣợc trình bày qua bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng
huyết thanh của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5
Thỏ
L.máu
Thỏ 3
(liều tiêm 1 ml)
Thỏ 4
(liều tiêm 1,5 ml)
Thỏ 5
(liều tiêm 2 ml)
Trƣớc khi tiêm
-
-
-
Sau mũi mẫn cảm
±
±
-
Sau mũi nhắc lại 1
±
±
Chết

Thỏ 1
Thỏ 2
Trung bình
Lần
1
Huyết thanh
1/1600
1/1600
1/1600
KHT đã thẩm tích
1/960
1/480
1/720
Lần
2
Huyết thanh
1/960
1/1280
1/1120
KHT đã thẩm tích
1/240
1/640
1/440
Lần
3
Huyết thanh
1/480
1/960
1/720
KHT đã thẩm tích

1000
1500
2000
lần 1 lần 2 lần 3
thời điểm lấy máu
hiệu giá KT
Huyết thanh
KHT đã thẩm tích

Biểu đồ 4.2 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu
và KHT đã thẩm tích ở qui trình ngắn ngày
4.1.2.2. Qui trình dài ngày
Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh
thỏ 3 và thỏ 4
Thỏ
Lấy máu
Thỏ 3
Thỏ 4
Trung bình
Sau mũi
nhắc lại 3
Huyết thanh
1/1280
1/960
1/1120
KHT đã thẩm tích
1/960
1/640
1/800
Sau mũi


37
Tƣơng tự nhƣ qui trình ngắn ngày, qui trình dài ngày có hàm lƣợng kháng thể
trong kháng huyết thanh sau khi tủa bằng ammonium sulfate và thẩm tích thƣờng thấp
hơn lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh thô lúc đầu.
0
500
1000
1500
2000
2500
mũi nhắc lại 3 mũi nhắc lại 4
thời điểm lấy máu
hiệu giá KT
huyết thanh
KHT đã thẩm tích

Biểu đồ 4.4 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu
và KHT đã thẩm tích ở qui trình dài ngày

4.1.2.3. Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch ở 2 qui trình
Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch đƣợc đánh giá qua việc so sánh trung bình hiệu
giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ sau lần tiêm nhắc lại thứ 4 ở qui
trình ngắn ngày và sau lần tiêm nhắc lại thứ 3, thứ 4 ở qui trình dài ngày. Kết quả đƣợc
thể hiện qua bảng 4.5.
Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ
ở qui trình ngắn ngày và dài ngày
Qui trình ngắn ngày
Qui trình dài ngày
Lần 1

trên phiến kính ta thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 4.6 Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh
gắn S. aureus ở các nồng độ khác nhau
V
KHT
: V
S. aureus

Nồng độ
S. aureus
(tế bào / ml)
1:4
1:9
10
9
++
+
10
10
++
+
10
11
++
+
10
12
++
+
10

S. aureus
Việc xử lí kháng huyết thanh với S. aureus đã làm tăng độ nhạy của phản ứng
ngƣng kết, điều này có thể sẽ cho phép xác định chính xác hơn thời điểm xuất hiện 39
kháng thể. Dựa vào kết quả ở mục 4.1.3.1., tiến hành xử lí kháng huyết thanh với dịch
vi khuẩn S. aureus có nồng độ 10
14
tế bào/ ml với tỉ lệ thể tích KHT : dịch vi khuẩn là
1:4. Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính đƣợc trình bày ở bảng 4.6 và 4.7

a. Qui trình ngắn ngày
Bảng 4.7 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng
huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 1 và thỏ 2
Thỏ

Lấy máu
Thỏ 1
Thỏ 2
Không xử lí
với S. aureus
Xử lí với
S. aureus
Không xử lí
với S. aureus
Xử lí với
S. aureus
Trƣớc khi tiêm
-

+
+
+
++
Lấy máu lần 3
+
+++
+
+

So với KHT không gắn S. aureus thì KHT gắn S. aureus cho kết quả phản ứng
ngƣng kết trên phiến kính rõ ràng hơn. Tuy nhiên không có sự khác biệt về thời điểm
phát hiện kháng thể. Ở cả hai trƣờng hợp đều cho kết quả phản ứng ngƣng kết dƣơng
tính với mẫu đƣợc lấy sau tiêm mũi nhắc lại lần 2.
b. Qui trình dài ngày
Bảng 4.8 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng
huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5
Thỏ

L.máu
Thỏ 3
Thỏ 4
Thỏ 5
Không
xử lí với
S.aureus
Xử lí với
S. aureus
Không
xử lí với

+
±
+
Sau mũi nhắc lại 3
±
++
+
++
Sau mũi nhắc lại 4
+
+++
++
+++ 40
Kết quả cho thấy kháng thể nếu đƣợc gắn với protein A của S. aureus sẽ cho phản
ứng ngƣng kết rõ hơn so với kháng thể không gắn protein A. Sau khi tiêm mũi mẫn
cảm 14 ngày thì kháng thể xuất hiện và phản ứng ngƣng kết thấy rõ hơn khi tiêm mũi
gây mẫn cảm với liều cao hơn. Ở các mũi nhắc lại tiếp theo thì phản ứng ngƣng kết
thấy càng rõ. Đặc biệt ở thỏ 5, sau khi xử lí với S. aureus đã có thể phát hiện đƣợc
kháng thể ngƣng kết ngay sau mũi tiêm mẫn cảm trong khi với kháng huyết thanh
không xử lí cho kết quả (-).
4.1.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh
Do kháng nguyên sử dụng là nguyên tế bào vi khuẩn E. coli vì vậy sẽ có các
kháng thể đặc hiệu chung cho các loài vi khuẩn E. coli đƣợc tạo thành trong kháng
huyết thanh. Nhằm tăng độ đặc hiệu của phản ứng ngƣng kết cần thiết phải loại bỏ các
kháng thể đặc hiệu chung này. Trong thí nghiệm, chúng tôi đã thử cho KHT hấp phụ
với kháng nguyên chủng vi khuẩn E. coli E68 để trong KHT chỉ còn lại những kháng
thể đặc hiệu cho H28.

(n=2)
1/48
1/48
1/48
1/20
1/41
Lần
2
Không h. phụ
(n=2)
1/960
1/240
1/1280
1/640
1/780
Hấp phụ E
68

(n=2)
1/48
1/6
1/48
1/48
1/38
Lần
3
Không h. phụ
(n=2)
1/480
1/640

Mũi
nhắc
lại 3
Không h. phụ
(n=2)
1/1280
1/960
1/960
1/640
1/960
Hấp phụ E
68
(n=2)
1/16
1/12
1/64
1/24
1/29
Mũi
nhắc
lại 4
Không h. phụ
(n=2)
1/1280
1/320
1/2560
1/1920
1/1520
Hấp phụ E
68