31
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 LY TRÍCH DNA
4.1.1 So sánh DNA ly trích từ cơ thu hồi theo hai mức độ làm khô
DNA cơ bò được làm khô theo hai mức độ I và II, kết quả đo OD được trình
bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1 Tỷ số OD và hàm lượng DNA thu hồi theo hai mức độ làm khô
Chỉ tiêu
Mức độ I (
X
± SD) Mức độ II (
X
± SD)

Sai biệt thống kê
Tỷ số OD 1,86 ± 0,01 1,93 ± 0,04 P = 0,15
Hàm lượng DNA (µg / µl) 0,43 ± 0,06 0,37 ± 0,04 P = 0,50
Số mẫu 11 11

1.86
0.43
1.93
0.37
0
0.5
1
1.5
2
Mức độ I Mức độ II
Tỷ số OD

0.5
1
1.5
2
DNA cơ DNA lông
Tỷ số OD
Hàm lượng DNA
(µg /µl)Qua kết quả ở bảng 4.2, DNA ly trích từ cơ khá tinh sạch và có hàm lượng cao
hơn so với DNA ly trích từ lông một cách rất có ý nghĩa (p < 0,01). Cơ vân chứa các tế
bào đa nhân nên lượng DNA ly trích được rất nhiều. Hơn nữa, protein của cơ dễ bị
phân hủy hơn keratin ở lông nên DNA ly trích có độ tinh sạch cao hơn DNA từ lông.
Tuy nhiên, muốn có được lượng DNA tinh sạch này, thường phải giết chết con vật
hoặc lấy mẫu sinh thiết. Chính cản trở này đã làm cho việc ly trích DNA từ những con
vật quí hiếm thêm khó khăn. Từ đó, việc tìm ra qui trình ly trích DNA từ lông là điều
rất cần thiết.
4.1.3 Kết quả ly trích DNA từ gốc lông và ngọn lông
Sau khi đo OD của 10 mẫu DNA lông (5 mẫu gốc lông, 5 mẫu ngọn lông),
chúng tôi tính toán các giá trị thống kê (xem bảng 4.3). Biểu đồ 4.2 So sánh DNA ly trích từ cơ và lông
33
Bảng 4.3 Tỷ số OD và hàm lượng DNA ly trích từ gốc lông và ngọn lông
Chỉ tiêu Gốc lông Ngọn lông Sai biệt thống kê
Tỷ số OD 1,77 ± 0,07 1,22 ± 0,03 P = 0,001
Hàm lượng DNA (µg / µl) 0,03 ± 0,01 0,02 ± 0,01 P = 0,34
Tổng số mẫu 5 5

lông (sử dụng loại enzyme phân cắt keratin, tạo điều kiện hoạt động cho enzyme hoặc
tăng lượng lông cần ly trích).
Biểu đồ 4.3 So sánh DNA ly trích từ ngọn lông và gốc lông
34
4.2 KẾT QUẢ PCR XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH
4.2.1 Kết quả xây dựng qui trình PCR
4.2.1.1 So sánh hai chu trình nhiệt
Sau khi tiến hành xác định giới tính trên giống bò ta Vàng bằng hai chu trình
nhiệt khác nhau, chúng tôi nhận được kết quả ở bảng 4.4.
Bảng 4.4 Tỷ lệ thành công của hai chu trình nhiệt
Chu trình nhiệt Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%)
I 5 0 0
II 9 9 100
Sai biệt thống kê

P = 0,002

Kết quả xác định giới tính trên giống ta Vàng bằng Taq ABgene 1,5 UI ở chu
trình nhiệt II thành công hơn rất nhiều so với chu trình nhiệt I (p < 0,01). Sự khác biệt
chủ yếu giữa chu trình nhiệt II so với chu trình nhiệt I là tăng thời gian trong giai đoạn
2 lên 1 phút ở tất cả các bước (biến tính, ủ bắt cặp và kéo dài).
Theo Sambrook và Russell (2001), thời gian của mỗi bước trong giai đoạn chạy
chu kỳ ảnh hưởng quyết định đến năng suất sản phẩm PCR. Nếu thời gian biến tính
không đủ lâu để cắt đứt hoàn toàn các liên kết hidro trong mạch đôi thì giai đoạn bắt
cặp sẽ không đạt hiệu quả cao. Thời gian kéo dài chuỗi nếu ít cũng gây ra kết quả
không chuyên biệt. Theo lý thuyết, tốc độ kéo dài chuỗi của Taq polymerase là 2000
nucleotide / phút. Tuy nhiên, trong thực tế, người ta thường xem loại Taq này kéo dài
1000 nucleotide trong vòng 1 phút. Theo chu trình của Alves và ctv (2003), thời gian
mỗi bước trong giai đoạn 2 đều là 45 giây. Nhóm tác giả này đã xác định giới tính
chính xác 100% khi tiến hành với chu trình nhiệt ấy. Nhưng khi thí nghiệm với cùng


Hình 4.1 Sản phẩm PCR từ hai chu trình nhiệt
I: chu trình nhiệt I; II: chu trình nhiệt II
36
giới tính của bò. Thực tế, buffer PCR của Bio-rad và ABgene mới đáp ứng được điều
này còn buffer của Promega chỉ có 10 mM Tris - HCl. Do đó, chúng tôi phải bổ sung
thêm Tris - HCl (pH 8,3) để đạt nồng độ Tris - HCl trong buffer PCR là 20 mM.
Nhưng sự bổ sung này cũng không mang lại hiệu quả. Ngoài ra, mỗi loại Taq được sản
xuất ở mỗi hãng đều theo một qui cách khác nhau và như thế đều có thể ảnh hưởng
đến kết quả PCR.

Như vậy, ta có thể sử dụng một trong hai loại Taq của hãng Bio-rad hoặc
ABgene để tiến hành phản ứng. Tuy nhiên, Taq của Bio-rad (3.773.783 VNĐ / 250
UI) khi so sánh giá thành với Taq ABgene (1.798.381 VNĐ / 250 UI) thì đắt hơn gấp
2,5 lần. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định chọn Taq ABgene để tiến hành xác định
giới tính sau này.

Hình 4.2 Sản phẩm PCR từ ba loại Taq
37
4.2.2 Áp dụng qui trình PCR
4.2.2.1 Xác định giới tính của ba giống bò với DNA từ cơ
Qui trình PCR với Taq ABgene 1,5 UI theo chu trình nhiệt II được sử dụng để
xác định giới tính của ba giống bò ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan (DNA cơ).
Bảng 4.6 Kết quả áp dụng PCR lên xác định giới tính của ba giống bò
Giống Số mẫu tiến hành

Số mẫu thành công

Tỷ lệ thành công (%)
I 11 11 100
II 10 2 20
Sai biệt thống kê P = 0,001

Như vậy, tỷ lệ thành công khi tiến hành PCR trên mẫu DNA làm khô mức độ I
(100%) cao hơn so với mẫu DNA làm khô mức độ II (20%) một cách có ý nghĩa (p <
0,01).

Theo Svaren và ctv (1987), khi DNA được làm khô quá đáng thì nó có thể bị
biến tính do mất lớp vỏ ổn định của những phân tử nước gắn kết (trích dẫn bởi
Sambrook và Russell, 2001). Ở đây, đa số các mẫu được làm khô đến mức độ II có
biểu hiện giảm sút độ ướt rất nghiêm trọng, vệt tủa thường bám rất chặt lên thành
eppendorf và rất mờ, mới nhìn thì không xác định được vị trí vệt tủa. Có thể vì lý do
Hình 4.4 Sản phẩm PCR từ hai mức độ làm khô DNA cơ bò đực
S

V
39
đó mà DNA bị hỏng khá nhiều và không đủ làm mẫu cho phản ứng nhân bản (kết quả
2 band mờ, 1 band chuyên biệt NST X hoặc không cho band nào). Tuy nhiên, để
khẳng định điều này, cần phải có nhiều nghiên cứu sâu hơn nữa về tính chất của DNA
và thực hiện số mẫu nhiều hơn.
4.2.2.3 So sánh kết quả PCR trên DNA của cơ và lông
Sau khi tiến hành 10 phản ứng khuếch đại DNA trên các mẫu lông ở cả ba
giống, chỉ có 2 mẫu thành công, 8 mẫu còn lại không phân biệt được giới tính chính
xác. Tỷ lệ thành công trên mẫu lông là 20%, ít hơn so với mẫu cơ (100%) một cách có
ý nghĩa (p < 0,001). Trong đó, hai mẫu lông thành công đều là mẫu lông gốc (đạt
40%), các mẫu lông ngọn đều không thành công (0%).