28
Bảng 4.2. Điều kiện cho phản ứng PCR
Thành phần phản ứng
Nồng độ đầu
Nồng độ cuối
Thể tích
PCR Buffer
MgCl
2

dNTPs
Primer ITS4
Primer ITS5
Taq DNA polymerase
DNA khuôn mẫu
Nước cất vô trùng
10X
50 mM
2 mM
10 pmol/µl
10 pmol/µl
1UI
< 100 ng
1X
1,5 mM
0,2 mM
0,4 pmol/µl
0,4 pmol/µl
0,04 UI


72
0
C
72
0
C
3 phút

1 phút
45 giây
1 phút
7 phút

4.2.4. Kết quả khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani
Primer ITS 4 và ITS 5 là các universal primer được White và ctv. (1990) thiết kế
để khuếch đại vùng ITS nằm trong vùng rDNA của ti thể và nhân của nấm. Vùng
rDNA-ITS (gồm ITS1-5,8S-ITS2) có chiều dài khoảng 700 bp.
Sau khi chọn được quy trình thích hợp cho phản ứng PCR, chúng tôi đã tiến hành
khuếch đại đoạn rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani phục vụ cho mục đích tiếp
theo. Kết quả được thể hiện qua hình 4.5.
Kết quả điện di sản phẩm PCR của chúng tôi trên gel agarose cho thấy, chúng tôi
đã thu được một sản phẩm có kích thước khoảng 700 bp. Như vậy, chúng tôi đã
khuếch đại thành công vùng rDNA-ITS của nấm R. solani

29

Hình 4.5. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn rDNA-ITS
của các dòng nấm R. solani
1. XL-4; 2. RM-61; 3. BV-61-02; 4. CX-8-02;
5. CTĐ-77; 6. BV-62-03; 7. ĐHL-63; 8. KT-63


30

Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng rDNA-ITS
của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Alu I
1. RM-61; 2. BV-61-02; 3. CX-8-02; 4. CTĐ-77; 5. BV-62-03;
M. Ladder 100 bp; 6. KT-63-01; 7. XL-4; 8. L-73; 9. ĐHL-63.

Kết quả cho thấy, vùng rDNA-ITS của 3 dòng nấm R. solani (RM-61, BV-61-02,
và L-73) có một vị trí cắt của Alu I, và 6 dòng (CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63-
01, XL-4, và ĐHL-63) có hai vị trí cắt của Alu I, tạo ra các đoạn cắt có chiều dài khác
nhau.
Với enzyme Hae III, vùng rDNA-ITS của tất cả 9 dòng nấm R. solani nói trên đều
có hai vị trí cắt của enzyme này và cho ra ba phân đoạn DNA với chiều dài các đoạn
cắt khác nhau tùy theo dòng nấm. 9 dòng nấm này cho ra 5 kiểu cắt RFLP: kiểu H
1

(dòng RM-61, BV-61-02, CTĐ-77, BV-62-03, và L-73) với các băng có kích thước
khoảng 510 bp, 120 bp, và 90 bp; kiểu H
2
(dòng CX-8-02) với các băng có kích thước
khoảng 500 bp, 120 bp, và 90 bp; kiểu H
3
(dòng KT-63-01) với các băng có kích thước
khoảng 580 bp, 490 bp, và 120 bp; kiểu H
4
(dòng XL-4) với các băng có kích thước
khoảng 510 bp, 120 bp, và 80 bp; và kiểu H
5
(dòng ĐHL-63) với các băng có kích

3
(dòng CTĐ-77) với các phân đoạn
100bp
500bp
100bp
500bp
1 2 3 M 4 5 6 7
1 2 M 3 4 5 6 7 M 8 9

32
DNA có kích thước 340 bp, 320 bp, và 60 bp; và kiểu T
4
(dòng XL-4) với các phân
đoạn DNA có kích thước khoảng 340 bp, 310 bp, và 60 bp (Hình 4.8 và Bảng 4.4)
Kết hợp các kiểu cắt enzyme giới hạn bởi 3 enzyme (Hae III, Alu I và Taq I), 7
dòng nấm R. solani (trừ 2 dòng L-73 và ĐHL-63) có 6 dạng (rDNA-ITS): Dạng 1 (A
1
,
H
1
, T
1
), dạng 2 (A
2
, H
2
, T
2
), dạng 3 (A
3

phân lập từ các cây ký chủ khác nhau.

Bảng 4.4. Chiều dài các đoạn cắt giới hạn vùng rDNA-ITS đƣợc ƣớc tính (bp)
của 9 dòng nấm R. solani khi cắt với 3 enzyme Alu I, Hae III, và Taq I Enzyme
Dạng 1
(RM-61 và
BV-61-02)
Dạng 2
(CX-8-
02)
Dạng 3
(CTĐ-
77)
Dạng 4
(BV-
62-03)
Dạng 5
(KT-
63-01)
Dạng 6
(XL-4)

Dạng ?
L-73

Dạng ?
ĐHL-

(80)**
430
220
(70)
430
220
(70)
430
220
(70)
410
220
(80)
500
220
480
200
(50)
Hae III
H
1
H
2

H
1

H
1


510
120
(90)
530
120
(80)
Taq I
T
1
T
2

T
3

T
1

T
1

T
4
350
310
(60)
360


5.1 Kết luận
1. Có thể sử dụng quy trình ly trích DNA của Lee và Taylor (1990) có cải tiến để
ly trích DNA tương đối tinh sạch sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn rDNA-
ITS của nấm R. solani.
2. Đã cải tiến được chu trình nhiệt và các thành phần phản ứng PCR để khuếch
đại thành công vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani với cặp primer ITS 4 và
ITS 5.
3. Tính đa hình các đoạn cắt giới hạn giữa 9 dòng nấm R. solani (RM-61, BV-61-
02, CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63-01, XL-4, L-73, và ĐHL-63) đã được nhận
thấy khi cắt vùng rDNA-ITS với enzyme Alu I, Hae III, và Taq I. Phân tích ITS-RFLP
cho thấy, 7 dòng nấm R. solani nói trên (trừ 2 dòng L-73, và ĐHL-63) thuộc 6 nhóm
khác nhau.

5.2. Đề nghị
1. Hoàn thiện quy trình điện di để đọc được kết quả phản ứng cắt một cách chính
xác hơn.
2. Tiếp tục phân tích ITS-RFLP với nhiều enzyme cắt hạn chế hơn và trên nhiều
dòng nấm hơn để có thể đánh giá được chính xác hơn sự đa dạng di truyền của các
dòng nấm R. solani ở nước ta.
3. Nghiên cứu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của 9 dòng nấm R. solani đã được sử
dụng trong đề tài để xác định chính xác kiểu gen có thể có của các dòng nấm này.

34
Phần VI
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử: Những nguyên
tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh,
Việt Nam.

Nam.

10. Ou S. H., 1983. Bệnh hại lúa (Viện Bảo Vệ Thực Vật dịch). Nhà xuất bản
Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam.

11. Phạm Minh Sang, 2003. Hiệu lực của chế phẩm vi khuẩn đối kháng và kích
thích sinh trưởng trong phòng trừ bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani Kuhn)

35
trên lúa. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ
Chí Minh, Việt Nam.

12. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. NXB Khoa
Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, Việt Nam.

13. Lê Duy Thành, 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB Khoa Học và
Kỹ Thuật, Hà Nội, Việt Nam.
Tiếng Anh:
14. Carling D.E. and Sumner D.R., 1992. Rhizoctonia pp 157-165. In: Singlton
L., Mihail J.D. and Rush C.M. (eds), Methods for research on soilborne
phyto-pathologenic fungi. APS Press, St. Paul, Minnesota.

15. Fenille R. C., Ciampi M. B., Kuramae E. E., and Souza N. L., 2003.
Identification of Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil by
rDNA-ITS sequences. Fitopatol. bras. vol 28.

16. Hsiang T. and Dean J. D., 2001. DNA sequencing for anastomosis grouping
of Rhizoctonia solani isolates from Poa annua. International turfgrass society
9: 674-678.


subgroup of Rhizoctonia solani Anastomosis Group 1 (AG-1-ID), Causal
agent of a necrotic leaf spot on coffee. Phytopathology 91:1054-1061.

24. Reader U., and Broda, 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous
fungi. Letter in Applied Microbiology 1: 17-20.

25. Schneider J. H. M., Salazar O., Rubio V., and Keijer, 1997. Identification of
Rhizoctonia solani associated with field-grown tulips using ITS rDNA
polymormphism and pectic zymograms. Plant Pathology 103: 607 – 622.

26. Sharma S., Rustgi S., Balyan H. S., and Gupta P. K., (unknown year).
Internal transcribed spacer (ITS) sequences of ribosomal DNA of wild barley
and their comparsion with ITS sequences in common wheat. Molecular
Biology Laboratory, Department of Agricultural Botany Ch. Sharan
University, Meerut-250 004, India.

27. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., and Taylor, J., 1999. Amplification anhd
direct sequencing of fungal ribosome ARN genes for phylogenetics. P 315 -
322. In: Innis M. A., Gelfanhd D. H., White J. J. (eds) PCR protocols, a guide
to methods and applications. Academic Press, New York.

Web