1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN HỮU LẠC THỦY
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID
CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG
(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc
Mã số: 62.73.15.01
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2014
2
Công trình được hoàn thành tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. VÕ THỊ BẠCH HUỆ
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường
họp tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Vào ……. giờ ……. ngày ……. tháng …… năm …….
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện khoa học Tổng hợp TPHCM
- Thư viện Đại học Y Dược TPHCM
3
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN

chromatographic column technique”, Proceeding of The 7
th
Indochina
Conference on Pharmaceutical Sciences, pp 600-603.
8. Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi Phuong Trang
(2011), “Isolation and identification of isoquercitrin from the leaves of
4
Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”, Proceeding of The 7
th
Indochina
Conference on Pharmaceutical Sciences, pp 604-606.
5
GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Đặt vấn đề
- Cây Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae)
là dược liệu đang được sử dụng phổ biến như thực phẩm chức năng,
hoặc dạng bào chế thuốc để điều trị các dạng u xơ tử cung, u tuyến
tiền liệt.
- Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây TNHC được
nhiều tác giả quan tâm và có nhiều công trình đã công bố. Tuy nhiên
các nghiên cứu về lĩnh vực kiểm nghiệm thì hạn chế hơn. DĐVN IV
hiện vẫn chưa có chuyên luận cho cây TNHC. Do đó, công tác đảm
bảo chất lượng của nguyên liệu và các chế phẩm có TNHC vẫn chưa
được thực hiện một cách chặt chẽ. Nguyên nhân chủ yếu là do thành
phần hóa học của dược liệu này vẫn chưa được công bố một cách
toàn diện; chưa có công trình khoa học nào khẳng định chất đánh dấu
và hoàn toàn chưa có bất kỳ chất đối chiếu (CĐC) có nguồn gốc từ
dược liệu này được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc
gia.
Với mong muốn giải quyết các bất cập hiện tại trong công tác “Đảm

hợp chất esculetin, 6-ethoxybuphanidrin, flazin và isoquercitrin được
phân lập lần đầu tiên từ cây TNHC.
3. Thiết lập 6 CĐC: crinamidin, 6-hydroxycrinamidin,
lycorin, hippadin, astragalin và isoquercitrin. Hiện tại, các CĐC này
đều chưa được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia.
4. Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu 4 quy trình phân tích
alcaloid hoặc flavonoid bằng HPLC và CE. Các quy trình này đều
chưa được công bố bởi bất cứ công trình nào trong nước và thế giới.
5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn
kiểm nghiệm TNHC. Hiện tại DĐVN IV và Dược điển các nước đều
chưa có chuyên luận này.
7
4. Bố cục luận án: có 120 trang chính: đặt vấn đề (2); chương 1:
TQTL (24); chương 2: PPNC (13); chương 3: KQNC (62), chương 4
BL (16); kết luận (2); kiến nghị (1). Và danh mục công trình (1);
TLTK (12).
NỘI DUNG LUẬN ÁN
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
- Thực vật học cây TNHC:
Tên khoa học: Crinum latifolium L., họ Thủy tiên
Amaryllidaceae.
Tên thông thường: Trinh nữ hoàng cung, Hoàng cung
trinh nữ, Tỏi lơi lá rộng, Náng lá rộng.
Đặc điểm hình thái: cỏ nhiều năm; thân hành, hình cầu, phía
trên có thân giả ngắn do các bẹ lá ôm sát nhau làm thành.
Phiến lá dạng bản, màu xanh nhạt, mép lượn sóng. Cụm
hoa tán, có 10-20 hoa. Hoa đều, lưỡng tính, màu tím hồng.
Nhị 6 rời nhau; màu trắng, bao phấn màu vàng 2 ô. Bầu
hạ, 3 ô. Vòi nhụy dạng sợi.
- Thành phần hóa học và tác dụng sinh học:

cầu về thẩm định.
- Quy trình xử lý mẫu: khảo sát quy trình chiết alcaloid và flavonoid
từ lá TNHC (dung môi chiết, số lần chiết) và dung môi pha mẫu.
- Phương pháp HPLC: khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ và pH pha
động, kỹ thuật rửa giải.
9
- Phương pháp CE: kỹ thuật điện di, dung dịch đệm (hệ đệm, nồng độ
đệm, pH dung dịch đệm); nồng độ SDS.
- Phương pháp dấu vân tay:
- SKLM: khảo sát các điều kiện phân tích về dung môi và
thuốc thử phát hiện để xác định các đặc trưng cơ bản của DVT–
SKLM của hai nhóm hoạt chất chính alcaloid và flavonoid của
TNHC qua hệ số R
f
và màu sắc của các vết đặc trưng.
- HPLC: ứng dụng các điều kiện của phương pháp HPLC vào
phân tích vân tay cho dược liệu TNHC. Ghi nhận thời gian lưu, phổ
UV-Vis, % diện tích của các pic đặc trưng. Xác định DVT– HPLC
của hai nhóm hoạt chất chính của TNHC.
2.2.4. Phương pháp thiết lập CĐC:
Thực hiện theo hướng dẫn của ASEAN, ấn bản về quy trình thiết lập
CĐC hóa học thứ cấp.
2.2.5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm
nghiệm dược liệu TNHC:
- Các chỉ tiêu hóa lý thông thường của dược liệu và phương pháp
thực hiện theo hướng dẫn của DĐVN IV.
- Chỉ tiêu định tính bằng bằng phương pháp dấu vân tay được khảo
sát với 6 CĐC alcaloid hoặc 2 CĐC flavonoid đánh dấu.
- Chỉ tiêu định tính và định lượng bằng phương pháp HPLC được
khảo sát với 2 CĐC alcaloid hoặc 2 CĐC flavonoid đánh dấu.

chiết flavonoid FL-SFE và alcaloid AL-SFE.
- Chiết alcaloid và flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt: bột lá sau
khi chiết SFE được tiếp tục chiết ngấm kiệt với cồn 70%. Dịch chiết
cồn được chiết flavonoid FL-NK và alcaloid AL-NK.
3.2 Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao chiết TNHC
- Các PĐ alcaloid và flavonoid được chiết từ các bộ phận của cây
TNHC, sau đó tách PĐ bằng VLC và phân lập các hợp chất bằng CC.
- Sử dụng chất hấp phụ là silica gel tẩm đệm pH 9 đối với mẫu phân
lập alcaloid; silica gel pH 4 cho mẫu phân lập flavonoid.
- Riêng 6-ethoxyundulatin (2) và 6-ethoxybuphanidirn (3) phải qua 3
giai đoạn: chiết lỏng – lỏng với ether ethylic để tách lấy nhóm kém
11
phân cực từ PĐ AL-SFE. Sử dụng 2 lần sắc ký cột, lần đầu sử dụng
chất hấp phụ silica gel RP-18 để loại tạp dầu béo, sau đó là silica gel
cỡ hạt nhỏ và rửa giải bằng n–hexan với tốc độ chậm để tránh dồn
vết.
Kết quả: phân lập được 17 hợp chất từ các cao TNHC. Trong đó:
- 1 alcaloid mới được công bố lần đầu tiên, cấu trúc được xác
định là 6-ethoxyundulatin.
- 7 hợp chất đã được công bố từ dược liệu khác, lần đầu tiên
được công bố từ TNHC: kaempferol, isoquercitrin, flazin, esuletin, p-
hydroxybenzoic, 6-ethoxybuphanidrin, 6-hydroxypowellin.
- 9 hợp chất đã được công bố trước đây từ TNHC: hippadin,
augustamin, lycorin, undulatin, crinamidin, 6-hydroxybuphanidrin, 6-
hydroxyundulatin, 6-hydroxycrinamidin và astragalin.
3.3 Thiết lập chất đối chiếu
- Các hợp chất có độ tinh khiết cao, khối lượng khoảng 500 mg và là
chất đánh dấu của cây TNHC được chọn để thiết lập CĐC.
- 6 nguyên liệu được chọn để thiết lập CĐC: 4 alcaloid là crinamidin,
6-hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin; 2 flavonoid là astragalin và

Phương trình hồi qui và hệ số tương quan như sau:
Crinamidin: ŷ = 70299x R
2
= 0,9994
6-hydroxycrinamidin: ŷ = 149967x R
2
= 0,9996
Lycorin: ŷ = 9088x R
2

= 0,9999
Hippadin: ŷ = 58426x R
2
= 0,9990
Astragalin: ŷ = 21716x R
2
= 0,9969
Isoquercitrin: ŷ = 17244x R
2
= 0,9991
Nhận xét: có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
pic của các CĐC trong khoảng nồng độ khảo sát (R
2
> 0,998).
- Độ chính xác:
Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.2. RSD% độ tinh khiết sắc
ký của các pic chính < 2%.
Như vậy, các quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký các CĐC đạt yêu
cầu về độ chính xác.
13

(cm
-1
) 3200 (-OH); 1616 (C=C); 1046 (-
OCH
2
O-).
- ESI-MS (+): m/z = 318,46 [M+H]
+
, M phù hợp với công
thức nguyên C
17
H
19
NO
5
.
-
1
H-NMR (500 MHz, CDC1
3
): δ
H
(ppm) 1,59 (2H; m; H-
4); 2,02 (1H; m; H-11); 2,39 (1H; dt; J=6; 11,5 Hz; H-
11*); 2,79 (1H; m; H-12); 3,17 (1H; m; H-4a); 3,17 (1H;
m; H-12*); 3,27 (1H; t; J = 2,5 Hz; H-2); 3,70 (1H; d; J =
17,5 Hz; H-6β); 3,76 (1H; d; J = 3 Hz; H-1); 3,97 (3H; s;
H-14); 4,18 (1H; d; J = 17,5 Hz; H-6α); 4,47 (1H; d; J =
2,5 Hz; H-3); 5,87 (2H; dd; J = 6,5; 1,5 Hz; H-13); 6,63
(1H; s; H-10).

công thức nguyên C
17
H
19
NO
6
.
15
-
1
H-NMR (500 MHz, CDCl
3
+MeOD): δ
H
(ppm) 1,52 (1H;
m; H-4β); 1,60 (1H; m; H-4α); 1,77 (1H; m; H-11); 2,35
(1H; m; H-11*); 2,70 (1H; m; H-12); 3,12 (1H; m; H-12*);
3,28 (1H; brt; H-2); 3,68 (1H; dd; J = 13,5; 10 Hz; H-4a);
3,74 (1H; d; J = 3,5 Hz; H-1); 4,05 (3H; s; H-14);
4,43(1H; d; J = 2 Hz; H-3); 5,19 (1H; s; H-6); 5,90 (2H; d;
J = 1 Hz; H-13); 6,65 (1H; s; H-10).
-
13
C-NMR (125 MHz, CDCl
3
+MeOD): δ
C
(ppm) 28,7 (C-
4); 35,5 (C-11); 42,1 (C-10b); 46,3 (C-12); 53,7 (C-1);
54,6 (C-4a); 56,4 (C-2); 59,7 (C-14); 64,9 (C-3); 85,2 (C-

10b); 2,60 (1H; d; J =10,5 Hz; H-4a); 3,19 (1H; m; H-
12*); 3,32 (1H; d; J = 14,5 Hz; H-6β); 3,97 (1H; br s; H-
2); 4,01 (1H; d; J = 14 Hz; H-6α); 4,27 (1H; brs; H-1);
4,78 (1H; d; J = 4 Hz; 1-OH); 4,89 (1H; d; J = 6,5 Hz; 2-
OH); 5,36 (1H; brt; H-3); 5,94-5,95 (2H; 2d; J = 0,5; 1 Hz;
H-12); 6,67 (1H; s; H-7); 6,80 (1H; s; H-10).
16
-
13
C-NMR (125 MHz): δ
C
(ppm) 28,1 (C-11); 40,2 (C-
10b); 53,3 (C-12); 56,7 (C-6); 60,8 (C-4a); 70,2 (C-1);
71,7 (C-2); 100,5 (H-12); 105,0 (C-10); 106,9 (C-7); 118,4
(C-3); 129,6 (C-6a); 129,7 (C-10a); 141,7 (C-4); 145,2 (C-
8); 145,6 (C-9).
Dữ liệu phổ của CĐC hippadin:
- UV/methanol: λ
max
(nm) 247; 297 và 349.
- IR (KBr): υ
max
(cm
-1
) 1675 (C=O); 1620 (C=C); 1036 (C-
O).
- ESI-MS (+): m/z = 286,31 [M+Na]
+
, M phù hợp với công
thức nguyên C

max
(nm) 265 và 347.
- IR (KBr): υ
max
(cm
-1
) 3284 (OH); 1654 (C=O); 1068 (C-
O).
17
- ESI-MS (+): m/z = 471,31 [M+Na]
+
, M phù hợp với công
thức nguyên C
21
H
20
O
11
.
-
1
H-NMR (500 MHz, DMSO): δ
H
(ppm) 3,08 (2H; br s;
H-3” và H-4”); 3,18 (1H; m; H-2”); 3,21 (1H; m; H-5”);
3,32 (1H; m, H-6”a); 3,56 (1H; dd; J = 11,5; 5 Hz, H-6”b);
5,46 (1H; d; J = 7,5 Hz, H-1”); 6,21 (1H; d; J = 2 Hz, H-
8); 6,43 (1H; d; J = 2 Hz, H-6); 6,88 (2H; d; J = 9 Hz, H-
3’, H-5’); 8,04 (2H; d; J = 9 Hz, H-2’, H-6’); 10,19 (1H; s;
4’-OH); 10,87 (1H; s; 7-OH); 12,62 (1H; s; 5-OH).

-
1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d
6
): δ
H
(ppm) 3,08 (2H;
overlapped; H-3” và H- 4”); 3,24 (1H; overlapped; H-5”);
3,24 (1H; overlapped; H-2”); 3,32 (1H; overlapped, H-6”);
3,58 (1H; d; J = 11,5 Hz, H-6”); 5,46 (1H; d; J = 7,5 Hz,
18
H-1”); 6,20 (1H; d; J = 2 Hz, H-6); 6,40 (1H; d; J = 2 Hz,
H-8); 6,84 (1H; d; J = 9 Hz; H-5’); 7,57 (1H; overlapped,
H-6’); 7,58 (H; overlapped, H-2’);12,62 (1H; s; 5-OH).
-
13
C-NMR (125 MHz, DMSO-d
6
): phần đường δ
C
(ppm)
61,0 (C-6”); 69,9 (C-4”); 74,1 (C-2”); 76,5 (C-5”); 77,5
(C-3”); 100,9 (C-1”); phần aglycon δ
C
(ppm) (C-5’); 116,2
(C-2’); 121,1 (C-1’); 121,5 (C-6’); 144,8 (C-4’); 148,4 (C-
3’); 93,5 (C-8); 98,6 (C-6); 103,9 (C-10); 115,2; 133,3 (C-
3); 156,2 (C-5); 156,3 (C-2); 161,2 (C-9); 164,1 (C-7);
177,4 (C-4).
- Xác định độ tinh khiết sắc ký: thực hiện phương pháp HPLC.

10 98,69 96,79 99,93 99,99 98,30 98,14
11 98,70 96,81 99,99 100,00 98,26 98,10
TB % 98,71 96,75 99,96 99,99 98,28 98,10
3.2.5 Xác định giá trị ấn định và giá trị công bố:
Bảng 3.25 Giá trị ấn định và giá trị công bố các CĐC.
Tên chất khảo
sát
x*% s
*
µ
x
X%
Crinamidin 98,74 0,023 0,007 98,74
6-
hydroxycrinamidi
n
96,75 0,017 0,006
96,74
Hippadin 99,99 0,009 0,003 99,99
Lycorin 99,98 0,020 0,006 99,98
Astragalin 98,28 0,115 0,037 98,25
Isoquercitrin 98,15 0,018 0,005 98,16
3.4. Xây dựng phương pháp HPLC,CE, dấu vân tay để định tính,
định lượng alcaloid hoặc flavonoid
20
Mẫu đối chiếu alcaloid: crinamidin (98,71%), 6-
hydroxycrinamidin (96,75%), 6-hydroxypowellin
(98,56%), 6-hydroxyundulatin (99,66%), undulatin
(98,50%) và 6-hydroxybuphanidrin (98,65%).
Mẫu đối chiếu flavonoid: astragalin (98,28%),

3.4.3 Quy trình định lượng đồng thời 2 flavonoid bằng HPLC
- Điều kiện sắc ký: các điều kiện sắc ký tương tự quy trình định
lượng alcaloid. Rửa giải đẳng dòng, pha động là hỗn hợp dung môi
acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH 4 (20 : 80), bước sóng
265 nm.
21
3.4.4 Quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid bằng CE
- Điều kiện điện di: cột mao quản silica nung chảy chiều
dài tổng cộng 64,5 cm; chiều dài hiệu quả 56 cm; đường
kính trong 50 μm. Thể tích tiêm mẫu 50 mbar x 5 giây,
điện thế 25 kV, nhiệt độ cột 25
o
C, sước sóng phát hiện
214 nm. Dung dịch điện di dinatri tetraborat 25 mM; SDS 50
mM; điều chỉnh pH 9,5 bằng natri hydroxid 1N, phối hợp
để được dung dịch điện di có 10% methanol.
Kỹ thuật điện di MEKC.
3.4.5 Quy trình định lượng đồng thời 2 flavonoid bằng CE
- Điều kiện điện di: các điều kiện điện di tương tự quy trình định
lượng alcaloid. Dung dịch điện di dinatri tetraborat 45 mM;
điều chỉnh đến pH 9,0 bằng acid boric, phối hợp với
methanol để được dung dịch điện di nền có 10% methanol.
Kỹ thuật điện di vùng CZE.
Khảo sát tính phù hợp hệ thống: các quy trình đạt yêu cầu.
Thẩm định quy trình phân tích: cả 4 quy trình đều đạt yêu cầu của
tính đặc hiệu; tính tuyến tính (R
2
≥ 0,998); độ chính xác (RSD của
các kết quả định lượng ≤ 5,3%); độ đúng với tỷ lệ phục từ 90 –
107%.

(RSD = 2,35%)
µ = 285,3 ± 8,5
(RSD = 3,71%)
Bảng 3.31 Kết quả định lượng flavonoid trong lá TNHC (n = 6).
Hàm lượng flavonoid trong lá TNHC (µg/g)
Phương pháp HPLC Phương pháp CE
Astragalin
µ = 266,0 ± 6,2
RSD = 2,21%
µ = 261,9 ± 9,7
RSD = 3,56%
Isoquercitrin
µ = 125,9 ± 2,6
RSD = 1,99%
µ = 126,0 ± 3,1
RSD = 2,32%
3.4.6 Phương pháp dấu vân tay định tính alcaloid hoặc flavonoid
Mẫu thử: alcaloid AL-SA hoặc flavonoid FL-SA.
Mẫu đối chiếu: các chất đối chiếu như trong phần định lượng alcaloid
và flavonoid bằng phương pháp HPLC.
Phương pháp DVT – SKLM:
Bản sắc ký tráng sẵn silica gel F
254
; chiều dài 10 cm; chiều rộng giữa
các vết khoảng 1cm; khai triển một lần ở nhiệt độ phòng.
Dung môi:
Mẫu thử alcaloid: cloroform – methanol – dd amoniac (5 : 1 :
0,05)
Mẫu thử flavonoid: cloroform – methanol – acid formic (3 : 1 :
1)

(nm)
- DVT– HPLC alcaloid: mẫu thử có ít nhất 6 pic đặc trưng như sau:
Pi
c
Thời gian lưu (phút)
diện
tích
(%)
Phổ UV-Vis
1
9,0 ± 0,5 (6-
hydroxycrinamidin)
21,9
Các pic alcaloid
đều có phổ UV
tương tự:
2 10,5 ± 0,5 (6-hydroxypowelin) 17,8
24
λ
max
= 214 nm
vai ở 281 nm
3 13,5 ± 0,5 (crinamidin) 13,7
4
18,0 ± 0,5 (6-
hydroxybuphanidrin)
20,8
5
20,5 ± 0,5 (6-
hydroxyundulatin)

Dung môi B: dung dịch acid phosphoric pH 3 và 0,2%
TEA.
Dung dịch đối chiếu: hòa tan crinamidin và 6-hydroxycrinamidin
trong pha động để có dung dịch đối chiếu có nồng độ lần lượt là 150
µg/ml và 100 µg/ml.
Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu vào cốc có
mỏ 250 ml, thêm 50 ml ethanol 70% (TT), siêu âm trong 30 phút ở
nhiệt độ 50 ± 2
o
C (x 3 lần. Cô dịch chiết ethanol đến gần cạn, để
nguội, kiềm hóa dịch chiết bằng bằng dung dịch amoniac 25% (TT)
đến pH 9 – 10. Chuyển vào bình lắng gạn, chiết lấy alcaloid bằng
cách lắc hỗn hợp trong bình lắng với 30 ml cloroform (TT) (x 3 lần).
Cô dịch chiết cloroform đến cạn dung môi, thu được cắn alcaloid.
Hòa tan phần cắn này trong bình định mức 10 ml với dung hỗn hợp
dung môi A và B (25 : 75), thêm dung môi đến vạch, lắc đều. Lọc qua
màng lọc 0,45 µm.
Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ Phenomenex (25 x 4,6 mm)
được nhồi pha tĩnh C8 (5 µm).
Detector: PDA, bước sóng 214 nm.
Rửa giải gradient.
Tốc độ dòng: 1ml/phút.