BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
*****

NGUYỄN HỮU LẠC THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG
QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID
VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG
(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014

B GIÁO DC VÀ ÀO TO B Y T
I HC Y DC THÀNH PH H CHÍ MIINH

công trình nào khác.

Ngi cam đoan, Nguyn Hu Lc Thy

i
MC LC
MC LC i
BNG CÁC CH VIT TT iii
DANH MC HÌNH NH v
DANH MC BNG BIU vii
DANH MC S  vii
T VN  1
CHNG 1: TNG QUAN TÀI LIU 3
1.1. Tng quan thc vt hc cây Trinh n hoàng cung 3
1.2. Tng quan hóa hc ca chi Crinum và cây Trinh n hoàng cung 5
1.3. Tng quan tác dng sinh hc chi Crinum và cây Trinh n hoàng cung 14
1.4. Chit hot cht t dc liu bng dung môi CO
2
lng siêu ti hn 21
1.5. Các phng pháp nghiên cu hóa hc ca cây Trinh n hoàng cung 22
1.6. Phng pháp thit lp cht đi chiu 24
CHNG 2: PHNG PHÁP NGHIÊN CU 27
2.1. Nguyên vt liu 27
2.2. Trang thit b 28


BNG CÁC CH VIT TT
ASEAN Association of Southeast Asian Nations
(Hip hi các quc gia ông Nam Á)
AL-NK Phân đon alcaloid chit t lá TNHC bng phng pháp ngm kit
AL-SA Phân đon alcaloid chit t lá TNHC bng sóng siêu âm
AL-SFE Phân đon alcaloid chit t lá TNHC bng phng pháp SFE
AR-96 Phân đon alcaloid chit t r TNHC vi dung môi cn 96%
A
s
H s bt đi
CC Cht đi chiu
CE Caplillary Electrophoresis (in di mao qun)
Corr Area Corrected Area (Din tích pic đc chun hóa)
CZE Caplillary Zone Electrophoresis (in di mao qun vùng)
d doublet (đnh đôi)
DVN IV Dc đin Vit Nam xut bn ln th IV
DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DSC Differential Scanning Calorimetry (Nhit vi sai)
DMSO Dimethylsulfoxyd
DVT Du vân tay
ESI Electrospray Ionization (Ion hóa bng cách phun ion)
FL-NK Phân đon flavonoid chit t lá TNHC bng phng pháp ngm kit
FL-SA Phân đon flavonoid chit t lá TNHC bng sóng siêu âm
FL-SFE Phân đon flavonoid chit t lá TNHC bng phng pháp SFE
FR-96 Phân đon flavonoid chit t r TNHC vi dung môi cn 96%
GC Gas Chromatography (Sc ký khí)
GC-MS Gas Chromatography – Mass Spectrometry (Sc ký khí ghép khi ph)
GLP Good Laboratory Practices (Thc hành tt phòng kim nghim thuc)
HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sc ký lng hiu nng cao)

Thi gian lu (phút)
T
M
Thi gian di chuyn (phút)
TNHC Trinh n hoàng cung
TGA Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhit trng lng)
TT Thuc th
UV-Vis Ultraviolet-Visible (T ngoi kh kin)
VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sc ký ct chân không)
v

DANH MC HÌNH NH
Hình 1.1: Hình v cây TNHC 5
Hình 1.2: Các cu trúc hóa hc ca alcaloid khung crinin 6
Hình 1.3: Cu trúc hóa hc alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B) 6
Hình 1.4: Cu trúc hóa hc khung belladin (C) và cu trúc khung galanthamin (D) 7
Hình 1.5: Cu trúc hóa hc khung lycorenin (E) và cu trúc khung cheryllin (F) 7
Hình 1.6: Cu trúc hóa hc ca các flavonoid trong chi Crinum 8
Hình 1.7: Cu trúc hóa hc các hp cht flavonoid trong cây TNHC 10
Hình 3.1: Hình lá và cm hoa ca cây TNHC (Crinum latifolium L.) 40
Hình 3.2: Hình hoa Trinh n hoàng cung (Crinum latifolium L.) 40
Hình 3.3: SK các hp cht phân lp t các phân đon alcaloid. 48
Hình 3.4: SK các hp cht phân lp t phân đon alcaloid AR và flavonoid. 48
Hình 3.5: Cu trúc hóa hc và d liu ph NMR (500 MHz, CDCl
3
) ca (2). 58
Hình 3.6: Cu trúc hóa hc ca 6-ethoxyundulatin 58
Hình 3.7: SK xác đnh đ tinh khit ca CC crinamidin bng HPLC. 71
Hình 3.8: SK xác đnh đ tinh khit CC 6-hydroxycrinamidin HPLC. 72
Hình 3.9: SK xác đnh đ tinh khit ca CC lycorin bng HPLC. 72

đng methanol và acetonitril . 116

DANH MC S 
S đ 2.1 S đ kho sát quy trình chit hot cht t cây TNHC. 29
S đ 2.2 S đ kho sát chit hot cht t lá TNHC kt hp hai phng pháp SFE
và phng pháp chit ngm kit vi cn 70% 32

S đ 3.1 S đ chit cao cn, P alcaloid và P flavonoid t lá TNHC 42
S đ 3.2 S đ chit alcaloid và flavonoid t r TNHC. 42
S đ 3.3 S đ chit alcaloid và flavonoid bt lá kt hp hai phng pháp chit. 45
S đ 3.4 S đ phân lp hp cht (2) và (3) t P alcaloid AL-SFE. 50
S đ 3.5 S đ chit alcaloid AL-SA hoc flavonoid FL-SA. 82 vii

DANH MC CÁC BNG
Bng 1.1: Alcaloid ca TNHC Crinum latifolium L. 11
Bng 3.1: Hiu sut chit (%) hot cht bng phng pháp ngm kit. 41
Bng 3.2: Kt qu kho sát nh hng thi gian lên hiu sut chit. 43
Bng 3.3: Kt qu kho sát nh hng ca áp sut lên hiu sut chit. 44
Bng 3.4: Kt qu tách phân đon mu AL-SFE và FL-NK bng VLC. 46
Bng 3.5: Các hp cht tinh khit phân lp đc t cao chit TNHC. 47
Bng 3.6: Kt qu phân lp alcaloid t phân đon ALS1. 48
Bng 3.7: Kt qu trin khai sc ký ct vi cht hp ph pha đo. 49
Bng 3.8: Kt qu phân lp (2) và (3) t P n–hexan. 49
Bng 3.9: Kt qu phân lp các (8), (9), (10) t P alcaloid AL-NK. 51

Bng 3.29: Kt qu kho sát t l phc hi ca quy trình đnh lng đng thi 6
alcaloid trong lá TNHC bng phng pháp HPLC (n = 9). 87

Bng 3.30: Kt qu kho sát tình phù hp h thng ca quy trình đinh lng đng
thi astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bng phng pháp HPLC (n = 6). . 88

Bng 3.31: Kt qu kho sát đ chính xác ca quy trình đnh lng đng thi
astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bng HPLC (n = 6) 90

Bng 3.32: Kt qu kho sát đ đúng ca quy trình đnh lng đng thi astragalin
và isoquercitrin trong lá TNHC bng phng pháp HPLC (n = 9). 90

Bng 3.33: Kt qu kho sát tình phù hp h thng quy trình đnh lng đng thi 6
alcaloid trong lá TNHC bng phng pháp CE (n = 6). 91

Bng 3.34: Kt qu kho sát đ chính xác trung gian trong quy trình đnh lng đng
thi 6 alcaloid trong lá TNHC bng phng pháp CE (n = 6). 93

Bng 3.35: Kt qu kho sát t l phc hi ca quy trình đnh lng đng thi 6
alcaloid trong lá TNHC bng phng pháp CE (n = 9). 93

Bng 3.36: Kt qu kho sát tình phù hp h thng ca quy trình đnh lng đng
thi astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bng CE (n = 6). 94

Bng 3.37: Kt qu kho sát đ chính xác ca quy trình đnh lng đng thi
astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bng CE (n = 6). 96

Bng 3.38: Kt qu kho sát đ đúng ca quy trình đnh lng đng thi astragalin
và isoquercitrin trong lá TNHC bng phng pháp CE (n = 9). 96



có công trình công b vic đnh lng đng thi mt s alcaloid hay flavonoid trong
lá TNHC.
Dc đin Vit Nam IV cha có chuyên lun cây TNHC. Do đó, vn đ qun lý và
đm bo cht lng ca nguyên liu và các ch phm có thành phn TNHC vn cha
đc thc hin mt cách cht ch.
Nguyên nhân ch yu là do thành phn hóa hc ca dc liu vn cha đc nghiên
cu toàn din; cht đánh du trong nguyên liu cha đc xác đnh và hoàn toàn cha
có bt k cht đi chiu có ngun gc t dc liu này đc phân phi trên th trng.
Vi mong mun góp phn gii quyt các bt cp hin ti và góp phn vào công tác
“m bo cht lng” cho dc liu Trinh n hoàng cung, chúng tôi tin hành đ tài:
“Nghiên cu thành phn hóa hc, thit lp cht đi chiu
và xây dng quy trình kim nghim thành phn alcaloid và flavonoid
cho cây Trinh n hoàng cung - Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”
vi 4 mc tiêu chính nh sau:
1. Chit xut cao cn, các phân đon alcaloid, phân đon flavonoid và phân lp các
hp cht tinh khit t cây Trinh n hoàng cung.
2. Thit lp mt s cht đi chiu hóa hc có ngun gc t cây Trinh n hoàng cung.
3. Xây dng quy trình đnh tính, đnh lng alcaloid và flavonoid trong lá Trinh n
hoàng cung bng các phng pháp sc ký lng hiu nng cao và đin di mao qun.
4.  xut mt s ch tiêu cn thit cho vic xây dng tiêu chun kim nghim dc
liu Trinh n hoàng cung. 3
CHNG 1: TNG QUAN TÀI LIU
1.1. TNG QUAN THC VT HC CÂY TRINH N HOÀNG CUNG

1.1.2. Cây Trinh N Hoàng Cung (TNHC)
Tên khoa hc: Crinum latifolium L.
Tên thông thng: Trinh N Hoàng Cung [11], Hoàng Cung Trinh N [17], Ti li
lá rng [1], [4], Náng lá rng [4], [7], [9].
c đim hình thái: đc nhiu nhà thc vt hc Vit nam mô t rt chi tit [1], [4],
[5], [7], [11], [14], [17], [21]. Tài liu [7] phù hp vi hu ht các tài liu khác: c
nhiu nm; thân hành, hình cu, phía ngoài có áo mng, phía trên có thân gi ngn
do các b lá ôm sát nhau làm thành. Phin lá dng bn, kích thc 60-90

7-10 cm,
màu xanh nht, nc, mt trên hi lõm xung thành hình máng, mép ln sóng, gân
gia li lên  mt di, gân bên song song, chóp nhn, gc dng b. Cm hoa tán, có
10-20 hoa; cung cm dài 60-90 cm, chiu ngang 1,5-2,0 cm, màu xanh, gc tím nht.
Lá bc tng bao 2, dng mo, mng, kích thc 7,5-10,0

2,5-3,0 cm. Hoa đu, lng
tính, màu tím hng, đng thng; cung hoa ngn. Bao hoa dài 15-20 cm, 6 mnh,
dng tràng, phn di dính nhau thành ng dài 9-10 cm, thng đng hoc cong lên,
phn trên 6 thùy, hình mi giáo, gia lng có 1 di màu tím hng, đm hn, nht dn
ra phía mép, chóp nhn ngn, có mi màu hng. Nh 6, ri nhau; ch nh dài 6-7 cm,
dng si, màu trng, thng đng hoc choãi ra, đính  hng ng bao hoa; bao phn
màu vàng, dài 1,2-1,8 cm, 2 ô, hình di, đính lng, hng trong, m bng khe dc.
Bu h, hình thoi, 3 ô, mi ô 5-6 noãn; vòi nhy dài 15-18 cm, dng si, dài, mnh,
phía trên màu tím thm nht dn xung phía di; đu nhy nh, dng cu. Qu nang,
hình cu, đng kính 4-5 cm.
Tài liu [17] mô t b nh ca TNHC có màu đ, trong khi các tài liu khác [7], [11]
mô t b phn này có màu trng. Các tài liu còn li đu không đ cp chi tit này.

Thân hành là b phn đc nghiên cu nhiu nht, các hp cht alcaloid và flavonoid
đc tìm thy ch yu t b phn này.
6
1.2.1. Thành phn hóa hc ca các loài trong chi Crinum
1.2.1.1. Alcaloid ca chi Crinum
Alcaloid khung crinin: đây là nhóm đi din cho alcaloid Crinum do phn ln các
alcaloid đu thuc khung này vi hn 80 alcaloid đã đc phân lp. Cu trúc các
alcaloid khung này thay đi theo 3 cu trúc sau [107], [116]:

Hình 1.2: Các cu trúc hóa hc ca alcaloid khung crinin
Alcaloid khung lycorin: lycorin là nhóm đc xp th hai sau nhóm crinin v s
lng alcaloid vi khong 40 alcaloid đã đc phân lp. i din lycorin, đc tìm
thy trong 30 loài Crinum. K đn là hippadin, pratorimin và pratorinin [107], [116].
Alcaloid khung tazettin: khong 13 alcaloid thuc khung này, đi din là tazettin và
criwellin đc tìm thy trong 6-7 loài Crinum. Cu trúc các alcaloid khung tazettin
thay đi  v trí R
1
, R
2
, R
3
, R
4
, mt s ít (3 alcaloid) có cu trúc vòng methylendioxy
m và đc thay bng 2 nhóm CH
3
O- (ornamin - C

1

(A) (B)
Hình 1.3: Cu trúc hóa hc alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B)
Alcaloid kiu khung belladin: 7 alcaloid đã đc tìm thy, đi din là belladin [57],
latisodin và latisolin [55] đc phân lp t C. asiaticum và C. latifolium.
7
Alcaloid khung galanthamin: galanthamin là alcaloid đi din cho khung này, đc
tìm thy trong thân hành ca 8 loài Crinum. Các alcaloid còn li (khong 7 alcaloid)
có cu trúc thay đi theo khung Galanthamin.

(C) (D)
Hình 1.4: Cu trúc hóa hc khung belladin (C) và cu trúc khung galanthamin (D)
Alcaloid khung lycorenin: các alcaloid có cu trúc thay đi  các v trí
R
1
, R
2
, R
3
, R
4
.
Riêng
hippeastrin có cu trúc vòng methylendioxy  v trí R
1
và R

NO
3
và latifin - C
17
H
19
NO
3
.
Alcaloid khung phenanthridin: trisphaeridin - C
14
H
9
NO
2
và 3-hydroxy-8,9-
methylendioxyphenanthridin.

Alcaloid khung augustamin: augustamin - C
17
H
19
NO
4.

Alcaloid khung latindin: latindin - C
41
H
31
N

Cu trúc flavonoid nhóm flavon (C) (D) Cu trúc flavonoid nhóm chalcon (E)
Hình 1.6: Cu trúc hóa hc ca các flavonoid trong chi Crinum
Nhóm coumarin: ch mi đc tìm thy trong loài C. latifolium [104], hai hp cht
coumarin gm 4-[(senecioyloxy)methyl]-3-4-dimethoxycoumarin - C
17
H
20
O
6
và 4-
[(senecioyloxy)methyl]-6-7-dimethoxycoumarin - C
17
H
20
O
6
.
Nhóm terpenoid và sterol: các steroid thc vt nh stigmasterol, sitosterol,
dihydrositosterol đã đc tìm thy trong vài loài ca chi Crinum.
Nhóm acid béo: hn 20 acid béo nh linoleic, palmitic, arachidic, myristic, oleic,
palmitic, stearic… đc đnh danh t dch chit nc.
O
OH
R
2
O
R
1
R
3

OR
3
O
OR
4
R
2
OH
OH
R
3
O
R
1
9
Nhóm carbohydrat: gm resin, pectin, hemicellulose, glucan và polysaccharid. Thân
hành loài C. amabile cha 5,4% saccharid; 8,7% pectin, 8,2% hemicellulose. Glucan
A và B t loài C. latifolium, glucan A cha 12 đn v glucose và 110 gc ca glucose.
Glucose, arabinose, xylose, galacturonic và glucuronic acid đc phân lp t dch
chit nc ca thân hành loài C. bulbispermum.
1.2.2. Thành phn hóa hc ca TNHC - Crinum latifolium L.
- Thành phn hóa hc loài C. latifolium kho sát t nm 1982 do nhóm tác gi nc
ngoài nh Ghosal S. [53], [55], [56], [57], [58], [59], [60], [61], [62], Kobayashi S.
[83], [84] thc hin.
- Nhng nghiên cu  Vit Nam v thành phn hóa hc ca loài này phi k đn các
công trình ca các tác gi Phan Tng Sn [9], Nguyn Công Hào [8], [33], [102],
Nguyn Hi Nam [103], [104], Võ Th Bch Hu [11], [12], [13], [14].

4’,7-dihydroxy-3’-methoxyflavan 4’,7-dihydroxy-3’-vinyloxyflavan 5,6,3’-trihydroxy-7,8,4’-trimethoxyflavon
7-hydroxy-8-methoxyflavanon 2’,4’,7
-
trihydroxydihydrochalconKaempferol
-
3
-
O
-

-
D
-
glucopyranosyl
Hình 1.7: Cu trúc hóa hc các hp cht flavonoid trong cây TNHC
O
OH
OH

OH
11
Bng 1.1: Alcaloid ca TNHC Crinum latifolium L.
Stt Tên alcaloid - TLTK CTPT R
1
R
2
R
3
R
4

Khung crinin

(I) (II)
(I)
1 11-O-acetylambellin [54]

C
20
H
23
NO
6

OMe


17
NO
3

OMe

H H H
13

Powellin [9], [84]
C
17
H
19
NO
4

OH H OMe H
16

6-hydroxybuphanidrin [9], [100]
C
18
H
21
NO
5

OMe



C
18
H
21
NO
5

OMe

H OMe H
12

6-hydroxyundulatin [9], [92]
C
18
H
21
NO
6

OMe

OH OMe H
14

Crinamidin [9], [11], [92]
C
16
H

H H
10

Hamyan-3-O-acety [83] C
18
H
19
NO
5
Ac H

(IV)
5
Crinafolidin [62]
, [61]
C
19
H
23
NO
6

12
Tên alcaloid - TLTK CTPT R
1
R
2

Pratorinin [9], [57]
C
16
H
11
NO
3

O H Me H
26

Pratosin [57] C
17
H
13
NO
3
O H Me Me
27

Pratorin (hippadin) [9], [57]
C
16
H
9
NO
3

O H -CH
2

19
NO
5

Ac OH
20

Lycorin-2-epi [62] C
16
H
17
NO
4
H OH
23

Lycorin-1-O--D-Glucosid [58] C
22
H
27
NO
9
Glc OH

(VII)
22

2-Epipancrassidin [62] C
16
H

21
NO
3
H H H Me
31

Latisolin [55] C
24
H
31
NO
8
Glc H H Me
O
O
N
R
1
O
H
R
2
H
N
O
O
OHOH
OH
N
R

33

Augustamin [9], [11], [93]
(khung augustamin)
C
17
H
19
NO
4

(X)
Khung cheryllin

34

Cheryllin [83] C
17
H
19
NO
3
OH H
(XI)
35

Latifin [58], [83], [84]
C
17
H

O
O
O
N
O
CH
3
N
R
1
H
3
CO
H
CH
3
R
2
OH
N
O
O
O
OH
O
O
N
O
OH
N

Tác dng chng oxi hóa:
- Liu 200 mg/kg, cao ethanol ca loài C. asiaticum làm gim lng đng trong
máu, gim cholesterol, triglycerid đc quan sát sau 15 ngày điu tr. ng thi, các
ch s men gan đu gim chng t cao chit có th bo v t bào gan theo c ch
chng oxi hóa trên mô gan ca chut b tiu đng [71].