CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ
CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
•
Tách chiết phân tách AND ngoại lai từ sinh vật
đích
•
Phản ứng nối AND – vector tạo phân tử AND
TTH
•
Chuyển AND TTH vào tế bào chủ
•
Chọn lọc các tế bào mang AND TTH
•
Sản xuất, tinh sạch protein

Các bước cơ bản tạo ADNtái tổ hợp
•
Endonuclease giới hạn (RE)
CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
•
Vector plasmid
•
Vector thực khuẩn thể
lambda
•
Cosmid
•
BAC
•
YAC

o
Promoter lac
o
Promoter trp
o
Promoter tac
o
Promoter trc
o
Promoter pL
o
Promoter gen 10 từ thực khuẩn thể T7
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
o
Promoter lac
Nồng
độ
glucose
Nồng
độ
lactose
Nồng
độ
AMPv
Vùng promoter – operator lac Mức độ
phiên
mã
Thấp Thấp cao Thấp
cao Thấp Thấp Thấp

Promoter tac và trc:
•
Chứa vùng -35 của promoter trp và vùng -10 của
promoter lac
•
khác nhau một cặp base duy nhất:

Promoter tac: vùng -35 của trp và -10 của lac cách nhau 16 base

Promoter trc: vùng -35 của trp và -10 của lac cách nhau 17 base
•
Đều được cảm ứng khi bổ sung IPTG vào môi trường
•
Mạnh hơn promoter trp 3 lần, hơn promoter lac 10 lần
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
o
Promoter Pl
•
Được kiểm soát bởi protein ức chế cI của thực
khuẩn thể lambda
•
Được kiểm soát nhờ sự nhạy nhiệt độ:

ở 30oC, thể ức chế cI được tổng hợp liên tục

liên kết
với operator của promoter Pl

ngăn cản dịch mã tổng
hợp protein đích


gen đích
được phiên mã
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
PROTEIN DUNG HỢP

Protein dung hợp= protein đích liên kết protein tế bào
chủ

bảo vệ protein đích khỏi sự phân hủy của protease tế
bào chủ

Gắn nối phần mã hóa của hai hay nhiều gen với nhau

Sự có mặt của protein chủ

protein dung hợp không thích
hợp cho ứng dụng lâm sàng

Protein chủ có thể ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của
protein đích

Cắt protein dung hợp:
•
Nối gen protein đích và protein chủ bằng một đoạn
oligonucleitide mã hóa cho các aa được nhận biết bởi
protease không phải của vi khuẩn
PROTEIN DUNG HỢP
ứng dụng của protein dung hợp
o

Để tăng lượng protein gen nhân dòng


tăng số bản sao plasmid

Cạn kiệt nguồn năng lượng tế bào

KHẮC PHỤC:
o
Sắp xếp liên tiếp các trình tự của gen theo
hướng có thể phiên mã và dịch mã
o
Yêu cầu trình tự nucleotide:
•
hai đầu 5’ kéo dài của mỗi đoạn gen có 3
nucleotide khác nhau, mỗi đầu chỉ bổ
sung cho một đầu kéo dài khác trên một
gen khác
•
Các đầu 5’ kéo dài bổ sung cho đầu 5’ của
một vector
•
Các đầu kéo dài ba nu được tạo thành
nhờ PCR với các cặp mồi có một vùng
nhận biết của RE ở đầu 5’
CCG
ATT
TAA
AGT
TCA

ở mức độ ARN: bộ ba AUG

ở mức độ ADN: bộ ba ATG
•
RBS và một vài codon đầu tiên của gen quan tâm không chứa các
trình tự gây cuộn xoắn nội phân tử sau phiên mã làm cản trở tương
tác RBS – ribosome
Cơ sở phân tử
•
Gen đánh dấu chọn lọc: gen kháng ampicillin
•
Promoter tac
•
Vị trí đa điểm tách dòng: NotI, PstI, HindIII
•
Vùng liên kết ribosome lacZ
•
Codon khởi đầu ATG cách RBS 8 nu theo chiều xuôi
•
Các yếu tố kết thúc phiên mã T1, T2 từ thực khuẩn thể
lambda.
Các vector biểu hiện dịch mã
Vector biểu hiện pKK233 - 2
•
Gen nhân dòng có các codon hiếm được sử dụng trong tế
bào chủ - hiện tượng không tương hợp tế bào

tế bào
chủ không tổng hợp đủ tARN nhận biết các codon
hiếm

enzyme màng (Dsb B,D)

Các protein ngoại lai chứa từ 3 cầu disulfua trở lên thường cuộn gập
không chính xác và tạo các thể vùi

khắc phục:

Đồng biểu hiện với enzyme hỗ trợ cuộn gập (ví dụ: disulfua isomerase)

Đồng biểu hiện với sự biểu hiện vượt mức của enzyme chu chất hòa tan
tạo liên kết disulfua (DsbC)
o
Sự có mặt của aa ở đầu N

bền với sự phân hủy của protease
o
Trình tự nhạy với protease:
•
Trình tự PEST – prolin (P), acid glutamic (E), serine (S), threonine (T)
•
Thường bị chặn hai dầu bởi các cụm aa tích điện dương (lysine,
arginine)

tín hiệu phân hủy cho protease

Thay đổi vùng PEST

tăng độ bền protein
Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ
Vấn đề

một
phần của tế bào chủ

tồn tại
bền qua nhiều thế hệ không
cần hóa chất chọn lọc
Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ
•
Vị trí cài nhập là vị trí không
mang gen cần thiết của NST
•
Được kiểm soát bởi một promoter
có thể điều khiển
•
AND đích phải có độ tương đồng
trình tự nhất định (ít nhất là
50nu) với ADN NST

trao đổi
vật lý (tái tổ hợp) giữa hai phân
tử AND

Quy trình cài nhập:
1. Nhận dạng vị trí cài nhập
2. Phân lập và nhân dòng một phần
hoặc tất cả vùng cài nhập NST
3. Gắn nối gen nhân dòng và một
promoter có thể điều khiển vào
đúng hoặc lân cận vị trí cài nhập
4. Chuyển bản thiết kế đoạn cài

lọc

hiệu quả không mong
muốn

loại bỏ gen đánh dấu
chọn lọc

Loại bỏ gen đánh dấu chọn lọc:
o
Thiết kế gen đánh dấu chọn lọc
chặn hai đầu bởi trình tự AND
đặc hiệu được nhận biết cắt
bởi enzyme đặc hiệu khi bổ
sung chất cảm ứng vào môi
trường
Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ
Sự tiết protein ở E.coli
•
Sự tiết protein: kết quả sự
đi qua màng tế bào vào
vùng chu chất, hoặc qua
màng ngoài vào môi
trường của protein

Tinh sạch protein dễ dàng
hơn

Tăng đô bền protein


o
Biến thể của vi khuẩn thông thường
o
Tồn tại ở dạng thiếu thành tế bào – kết quả của đột biến tự phát khi
xử lý các vk nhạy cảm với chất cảm ứng dạng L: penicillin,
lysozyme
o
Hiệu quả: biểu hiên mức độ cao protein ngoại lai + tiết hoàn toàn
protein đích
o
Đặc tính kháng nhiều kháng sinh

không được sử dụng làm dấu
chuẩn kháng ks trong các thí nghiệm nhân dòng

khắc phục: sử
dụng gen đánh dấu không mã hóa cho khả năng kháng ks.
Sự tiết protein ở E.coli
Gánh nặng trao đổi chất
1. Tăng số bản sao và/ hoặc kích thước plasmid

tăng nhu
cầu tế bào cho việc sao chép và duy trì plasmid
2. Giới hạn hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy
3. Biểu hiện cao cả protein đích và protein đánh dấu

làm cạn
kiệt nguồn aminoacyl – tARN, nguồn aa và nguồn năng
lượng của tế bào chủ
4. Sự biểu hiện vượt mức protein ngoại lai

Hệ quả của gánh nặng trao đổi chất