CHƯƠNG III: CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH

Các kỹ thuật huyết thanh là kỹ thuật sử dụng kháng thể để phát hiện protein kháng
nguyên của vi-rút, vi khuẩn hoặc những đáp ứng của vật chủ với vi-rút, vi khuẩn hay ký
sinh trùng trong mẫu huyết thanh. Trọng tâm của các kỹ thuật huyết thanh là xác định sự
tiếp xúc của vật chủ với mầm bệnh, tuy nhiên, các kỹ thuật này cung cấp ít thông tin về
tình trạng nhiễm bệnh của vật chủ hoặ
c của cả đàn thủy sản nuôi.

III.1. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH
III.1.1. Nguyên lý
Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên hòa tan ở liều lượng chuẩn sẽ
xuất hiện được kết tủa nhìn thấy được bằng mắt thường. Phản ứng này được dùng phổ
biến để phát hiện kháng nguyên khi đã có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc để phát hiện
kháng thể
khi có kháng nguyên hòa tan đặc hiệu. Phản ứng kết tủa bị ức chế khi có quá
thừa kháng nguyên hoặc kháng thể. Sự kết tủa tối ưu khi có nồng độ kháng nguyên phù
hợp với kháng thể.
Nguyên lý chung: kết tủa miễn dịch chỉ có thể sử dụng được khi cho kháng nguyên hòa
tan phản ứng với kháng thể cũng hòa tan. Hiện tượng kết tủa miễn dịch xảy ra in vitro.
Hiện tượng tủ
a những phức hợp phân tử do liên kết kháng nguyên-kháng thể là do hình
thành một mạng lưới ba chiều các phân tử kháng nguyên nối lại với nhau bởi các kháng
thể (Marrack, 1934) (hình 3.1).
34
Hình 3.1. Hiện tượng tủa với sự hình thành mạng lưới cân bằng
Việc hình thành mạng lưới kết tủa phải có nhiều điều kiện như sau:
- Kháng thể phải có ít nhất hai hóa trị.

lượng kháng nguyên đã cho vào mỗi ống và trọng lượng phân tử riêng của kháng nguyên
và kháng thể thì người ta có thể tính ra công thức của phức hợp
Sau khi ly tâm tách tủa, có thể lấy nước mặt rồi nếu cho thêm kháng nguyên vào những
ống đầu và kháng thể vào những ống cuối thì vẫn có được tủa thêm. Điều này cho phép
xác định được 3 khu vực:

35
- Trong những ống đầu là khu vực thừa kháng thể, nơi mà do thiếu kháng nguyên
nên đã ngăn không cho kết tủa hết kháng thể.
- Trong những ống cuối là khu vực thừa kháng nguyên nên cũng không cho phép
hình thành mạng lưới 3 chiều.
- Những ống gần nơi tủa tối đa tương ứng với khu vực tương đương ở đó kháng
nguyên và kháng thể có tỉ lệ nồng độ tố
i ưu cho phép tủa gần hết các phân tử
kháng thể và kháng nguyên. Hình 3.2. Hiện tượng tủa trong môi trường lỏng

Định lượng bằng đo độ đục
Dùng một tia sáng mạnh đơn sắc cho đi qua ống nghiệm trong đó đã có trộn kháng
nguyên với kháng huyết thanh tương ứng. Tia sáng sẽ càng bị khuếch xạ mạnh nếu tủa
càng nhiều. Việc định lượng được tiến hành tại vùng có thừa kháng thể và nhờ việc đọc
độ cản quang rồi so sánh với đường chuẩn. Việc sử dụng tia laser cho phép việc định
lượng có giá trị cao.
Kỹ thuậ
t này có rất nhiều ứng dụng trong việc định lượng các kháng nguyên khác nhau
mà nồng độ trong một môi trường sinh học trong khoảng mg/l như IgG, IgA, IgM…và
trong việc tìm các kháng kháng thể.


37
Miễn dịch khuếch tán vòng (kỹ thuật Mancini)
Kỹ thuật này dùng để định lượng kháng nguyên. Kháng thể đặc hiệu được hòa đều vào
trong thạch trước khi đổ dãy thạch lên trên kính hay hộp petri. Sau đó, đục các lỗ và cho
vào đó dung dịch kháng nguyên có độ pha loãng khác nhau. Kháng nguyên sẽ khuếch tán
và gặp kháng thể ngay trong thạch và tạo nên những vòng kết tủa mà bề mặt của nó sẽ tỉ
lệ thuận với nồng độ kháng nguyên. Việc định lượng được suy ra từ một đường bi
ểu diễn
chuẩn lập ra từ những nồng độ đã biết của kháng nguyên.
III.1.4.3. Miễn dịch khuếch tán điện
Miễn dịch khuếch tán điện đơn (kỹ thuật Laurell)
Xuất phát từ nguyên lý của kỹ thuật khuếch tán vòng, kỹ thuật này chỉ khác ở chỗ là sự di
chuyển của các kháng nguyên định lượng được thực hiện trong điện trường. Do đó vùng
kết tủa có hình tên lửa (còn gọi là điện di tên lửa) (hình 3.4). Chiều dài của hình tên lửa tỷ
lệ với nồng độ kháng nguyên. Kỹ thuật này nhạy hơn kỹ thuật Mancini nhưng dùng nhiều
chất phả
n ứng hơn.

Hình 3.4. Khuếch tán điện: 1,2,3 mẫu chuẩn; x: mẫu

Miễn dịch điện di (kỹ thuật Grabar và Williams)
Khi dung dịch định phân tích có chứa nhiều kháng nguyên thì khuếch tán kép không đủ
để xác định mọi đường kết tủa. Miễn dịch điện di bổ sung thiếu sót ấy bằng cách tách
trước các kháng nguyên theo tốc độ di chuyển của chúng trong điện trường rồi mới gây
tủa bằng kháng huyết thanh đặc hiệu rải trong một rãnh đào sẵn dọc theo chiều điện di.
Các đường tủa xuất hiện theo hình thức nh
ững cung ở hai bên rãnh.
Kỹ thuật này chủ yếu được dùng để định tính, cho phép đánh giá có hiện tượng tủa hay
không so với một đối chứng. Đây là một kỹ thuật tốt để xác định một Ig đơn dòng do tạo
ra một cung tủa dày hơn, cong và gần rãnh hơn đồng thời nối liền với cung tủa của Ig

III.2. PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH
III.2.1. Nguyên lý
Hiện tượng ngưng kết là do cơ chế hình thành một mạng l
ưới giữa kháng nguyên và
kháng thể cho phép một lượng các hạt ấy sáp lại với nhau để hình thành đám ngưng kết
đủ to để mắt thường có thể nhìn thấy được. Mạng lưới chỉ có thể xuất hiện với các kháng
thể có ít nhất là hai hóa trị. IgM với đến 10 vị trí kết hợp nên có khả năng ngưng kết
mạnh hơn IgG. Nói chung các kháng nguyên hữu hình bao giờ cũng đa hóa trị cho nên
không bị hạn chế
.
Ở phản ứng ngưng kết miễn dịch đòi hỏi kháng nguyên hữu hình. Đó là kháng nguyên có
kích thước lớn như hồng cầu và tế bào vi sinh vật. Kháng nguyên hữu hình có epitop bề
mặt có thể liên kết chéo với các kháng thể tạo thành từng cụm có thể nhìn thấy được bằng
mắt thường. Kháng thể trong phản ứng này gọi là kháng thể gây ngưng kết. Phản ứng
ngưng kết nhạy hơn phản
ứng kết tủa nên được dùng để định tính và bán định lượng
kháng thể trong huyết thanh.
Cơ sở lí hóa của phản ứng ngưng kết: một hỗn hợp bao gồm những tiểu phần lơ lửng
trong một dung môi. Các tiểu phần giữ được trạng thái. 39
III.2.2. Xếp loại các phản ứng ngưng kết
Người ta phân biệt thành ngưng kết chủ động hay trực tiếp trong đó hạt hữu hình đã có
mang sẵn những nhóm quyết định kháng nguyên đặc hiệu như hồng cầu, bạch cầu, tiểu
cầu, tinh trùng, vi khuẩn và ngưng kết thụ động khi các hạt chỉ là chất trơ làm giá đỡ cho
các quyết định kháng nguyên hòa tan đã được gắn một cách nhân t
ạo lên bề mặt của nó,
trong đó thường dùng là hồng cầu đã xử lý bằng formol.
III.2.2.1. Ngưng kết trực tiếp:

- Ngưng kết vi khuẩn (Bacterial agglutination): xác định kháng thể huyết thanh
được tạo ra để chống lại sự
nhiễm khuẩn.
- Ức chế ngưng kết (Agglutination inhibition): phát hiện một lượng nhỏ kháng thể
chống lại một tác nhân gây bệnh nào đó .

III.2.4. Mẫu phân tích
Mẫu huyết tương hay huyết thanh

III.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
III.2.5.1. Ư u đi ểm:
Kỹ thuật khá đơn giản
III.2.5.2. Nhược điểm:
Kháng nguyên của mầm bệnh muốn phát hiện phải ở
dạng hạt. Mặt khác phương pháp
này có tính nhạy không cao.

III.3. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG
III.3.1. Nguyên lý
Trong kỹ thuật này kháng thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Kỹ thuật
dựa trên tính chất của thuốc nhuộm khi được kích thích bởi bức xạ có bước sóng đặc hiệu
sẽ phát sáng. Chẳng hạn fluorescein phát huỳnh quang màu vàng lục, còn rodamin phát
quang màu đỏ da cam. Kháng thể gắn thuốc nhuộm huỳnh quang gọi là kháng th
ể đánh
dấu hoặc kháng thể huỳnh quang. 41
III.3.2. Phương pháp
III.3.2.1. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

phết, mô hay tế bào.
III.3.5.2. Nhược điểm:
Đòi hỏi phải sử dụng kháng thể huỳnh quang hoặc kháng huyết thanh. Việc đọc k
ết quả
đòi hỏi kỹ năng và kinh nghiệm của người thực hiện việc chẩn đoán để phân biệt những
trường hợp dương tính giả và âm tính giả. Phản ứng chéo của kháng thể với kháng
nguyên khá có thể xảy cho nên kháng thể sử dụng phải có tính chuyên biệt cao.

43Hình 3.7. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

III.4. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH LIÊN KẾT ENZYM
III.4.1. Nguyên lý
Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym (ELISA-Enzyme- Linked Immunosorbent Assay) là
kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng
độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kỹ thuật phóng xạ thì kỹ thuật này rất rẻ tiền và an
toàn hơn mà vẫn chính xác như nhau.
Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA giống như kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, nh
ưng thay
vì kháng thể gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang thì người ta gắn kháng thể với một
enzym. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất này
thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng
nguyên với kháng thể, thông qua cường độ màu người ta biết được nồng độ của kháng
nguyên cần phát hiện.
Kỹ thuậ
t ELISA được chia làm hai dạng là ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp. Các
enzym thường dùng trong kỹ thuật ELISA là β-galactoxidaza, glucooxidaza, peroxidazza


quang phổ kế.

45Hình 3.8. Kỹ thuật ELISA: (a) ELISA gián tiếp; (b) ELISA trực tiếp (KT: kháng thể; KN: kháng
nguyên; S: cơ chất)
III.4.4.2. Kỹ thuật ELISA trực tiếp
Thường được dùng để định tính hoặc định lượng kháng thể.
- Nhỏ dịch kháng nguyên cho hấp thụ lên thành giếng.
- Nhỏ tiếp kháng huyết thanh (chứa kháng thể) cần xét nghiệm rồi ủ. Nếu trong
huyết thanh có chứa kháng thể đặc hiệu thì sẽ gắn với nó.
- Thêm cộng hợp kháng- kháng thể đã gắn enzym. Kháng thể này được tạo thành để
kh
ống chế kháng thể người.
- Thêm cơ chất của enzym. Tốc độ thủy phân cơ chất gắn liền với sự thay đổi màu
của dung dịch và tỉ lệ thuận với lượng kháng thể cần xác định trong mẫu. Sự thay
đổi màu có thể quan sát bằng mắt thường hay quang phổ kế (hình 3.8b). 46
III.4.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
III.4.5.1. Ưu điểm:
Phương pháp ELISA là phương pháp khá nhạy và dễ thực hiện. Có thể xét nghiệm cùng
một lúc nhiều mẫu bệnh phẩm, thời gian thực hiện ngắn nên được xem như là phương
pháp vàng trong sàng lọc/phát hiện bệnh.
III.4.5.2. Nhược điểm:
Cần phải có kháng thể đơn dòng hay đa dòng phù hợp với kháng nguyên của mầm bệnh
cầ
n xét nghiệm.