Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
Lời cảm ơn
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới thầy
hướng dẫn PGS.TS Cao Văn Thu, người đã hướng tận tình và giúp đỡ tôi
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Đồng cảm ơn các thầy cô giảng dạy tại
Khoa Công nghệ Sinh học - Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong
suốt quá trình học tập.
Xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè và những người đã giúp đỡ và động viên
tôi trong thời gian qua. Với khát vọng thì nhiều nhưng thời gian và kiến thức
của bản thân có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những sai sót. Tôi rất mong sự
chỉ bảo của thầy cô và sự góp ý của các bạn. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2006
Sinh viên
Phạm Thị Ngọc
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
Chú giải chữ viết tắt
ADN : axit Deoxyribonucleic
B.cereus : Bacillus cereus ATCC 9946
B.pumilus : Bacillus pumilus ATCC 10441
B.subtilis : Bacillus subtilis ATCC 6633
D : Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Dmhc : Dung môi hữu cơ
E.Coli : Escheriachia Coli ATCC 25922
P.aeruginosa: Pseudomonas Nhiễm sắc thể aeruginosa VM 201
P.mirabilis : Proteus mirabilis BV 108
S(Spiral) : Xoắn lò xo
s : độ lệch chuẩn đã hiệu chỉnh
S.typhi : Salmonella typhi DT220
S.flexneri : Shigella flexneri DT 122
hành phân lập và nghiên cứu về chủng Streptomyces 40.16 với các mục đích sau:
+ Từ chủng Streptomyces đã được phân lập, chọn giống sinh tổng hợp
kháng sinh tốt nhất bằng chọn lọc ngẫu nhiên và đột biến,
+ Nghiên cứu môi trường nuôi cấy và điều kiện lên men tối ưu,
+ Nghiên cứu đặc điểm, hình thái và sinh lý nhằm xác định tên khoa học
của chủng Streptomyces 40.16 theo khóa phân loại ISP,
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
+ Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết, tách sản phẩm và các đặc tính
của kháng sinh do xạ khuẩn Streptomyces 40.16 tổng hợp lên.
PHần 1
TổNG QUAN
1.1. VÀI NẫT VỀ KHÁNG SINH [5][6][8][11]
1.1.1.Lịch sử
Năm 1928, nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Fleming trong khi
nghiên cứu tụ cầu khuẩn ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm
vào hộp peptri nuôi tụ cầu tạo thành vũng vụ khuẩn. Hiện tượng kỡ lạ này đó
được Fleming nghiên cứu và phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh
đó là Penicillium notatum một chủng tạo ra penixilin.
Năm 1941 penixilin được nghiên cứu sản xuất phục vụ điều trị cho
thương binh trong đại chiến thế giới thứ II và kỷ nguyên của chất kháng sinh
được thừa nhận. Cho đến nay người ta đó phỏt hiện và mụ tả khoảng hơn 8000
chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn.
Thuật ngữ kháng sinh (antibiotic) được Waksman N.A gọi từ 1944 khi ụng
phỏt minh ra streptomycin từ mụi trường nuôi cấy Streptomyces griseus
1.1.2 Định nghĩa
Kháng sinh là những hợp chất hóa học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng
ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một nhóm vi sinh vật xác
định (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa, virus) hay cả tế bào ung thư ở nồng
độ thấp.
Vancomycin
Moenomycin
2. kháng sinh chứa vũng
lacton lớn (macrocyclic
lacton)
Kháng sinh macrolid
Kháng sinh polyen
Ansamycin
Macrotetrolid
Erythromycin
Candicidin, nistatin
Rifamicin
Tetranactin
3. Quinon và các kháng
sinh cựng họ
Anthracyclin
Naphthoquinon
Benzoquinon
Cỏc tetracyclin
Adriamycin
Actinorhodin
Mitomycin
Tetracyclin,
teramycin
4. Các kháng sinh
aminoacid và peptid
Dẫn xuất aminoacid
Khỏng sinh betalactam
Khỏng sinh peptid
Chromopeptid
1.1.6 S mụ t quy trỡnh sn xut khỏng sinh
T i n h c h ế
G i ố n g t r u y ề n ủ t r o n g p h ò n g t h í n g h i ệ m
S i n h k h ố i
S i n h k h ố i k h ô
D ị c h
c h i ế t s i n h k h ố i
S ả n p h ẩ m
T i n h c h ế
B ì n h n h â n g i ố n g C 1 , C 2 , C 3
B ì n h l ê n m e n t ạ o k h á n g s i n h
T i n h c h ế
D ị c h l ọ c
D ị c h c h i ế t K S
đ ậ m đ ặ c
S ả n p h ẩ m đ ã k i ể m
n g h i ệ m
n g h i ệ m
S
ả n
p h ẩ m đ ó n g g ó i
S ả n p h ẩ m
T i n h c h ế
L ọ c
D ị c h s a u l ê n m e n
Khoa Cng Ngh Sinh Hc Lp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
Hình 1. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
thích tăng trọng. Rất nhiều chẩt kháng sinh được ứng dụng với mục đích này
(các kháng sinh nhóm tetracyclin, monenzin,…).
Khỏng sinh cũn được ứng dụng trong nông nghiệp trước hết để tiêu diệt
các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các bệnh khô vằn, vàng lụi ở
lúa (validamyin, blasticidin S, kasugamyxin, v.v…), bệnh thối cổ rễ ở các cây
có củ,v.v…Kháng sinh cũn kớch thớch nẩy mầm của hạt. Thường ngâm hạt
trong dung dịch kháng sinh trước khi gieo vừa để kích thích nẩy mầm, vừa tiêu
diệt mầm bệnh trong đất.
Khỏng sinh cũn được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để bảo quản
thực phẩm đóng hộp.Nếu dùng kháng sinh thực phẩm đóng hộp sẽ bảo quản
được lâu hơn, khử trùng ở nhiệt độ thấp hơn nên chất lượng thực phẩm giữ
được tốt hơn(ví dụ nizin).
1.2.ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN [1][9][11][14][15]
1.2.1 Đặc điểm của xạ khuẩn
* Đặc điểm chung của xạ khuẩn: (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn
thật (Eubacteria) có cấu tạo sợi như nấm (nấm tia) nhưng lại có khích thước và
cấu tạo tế bào gần giống vi khuẩn, chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên: trong
đất, nước và trong các chất hữu cơ.
- Những đặc điểm đặc trưng của xạ khuẩn :
+ Kích thước của xạ khuẩn nhỏ bé tương tự như vi kích thước vi khuẩn
+ Nhân của xạ khuẩn là nhân không điển hình
+ Màng tế bào xạ khuẩn khụng chứa xenlulo và kitin
+ Sự phân chia tế bào của xạ khuẩn theo kiểu của vi khuẩn
+ Xạ khuẩn không có giới tớnh
- Tuy vậy xạ khuẩn lại có hình thái, cấu tạo sợi, phát triển bằng phân
nháh thành những sợi nhỏ, dài gọi là khuẩn ti (hipha), mỗi khuẩn ti do một tế
bào hình thành, tập hợp của các khuẩn ti này gọi là hệ khuẩn ti.
* Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn :
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
+ Bào tử trần: được hỡnh thành do sự phân cắt của sợi bào tử, là cơ quan
sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bào tử trần có thể hình cầu, hình elipsoid, hình
que, hình trụ. Các bào tử tập hợp với nhau thành chuỗi 3- 50 bào tử hoặc nhiều
hơn. Bề mặt của bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xự xỡ (wa), cú gai (sp),
hoặc cú túc (ha).
* Đặc điểm sinh lý:
- Streptomyces là vi sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hoá cao. Để phát triển
chúng phân giải các hydrat cacbon làm nguồn thức ăn cung cấp vật chất và
nguồn năng lượng đồng thời thuỷ phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh
bột. Chúng cũng có thể khử nitrat thành nitrit.
- Streptomyces là vi sinh vật có thành tế bào kiểu CW1 có chứa L-DAP
(diaminopimelat) và glycin.
- Streptomyces là loài xạ khuẩn hụ hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu của
chúng thường là 25-30
0
C, một vài loài có thể mọc ở nhiệt độ cao hơn, pH tối ưu
thường từ 6,8-7,5.
- Khả năng tạo sắc tố của Streptomyces: sắc tố tạo thành từ Streptomyces
được chia thành bốn loại: sắc tố hoà tan, sắc tố khuẩn ty cơ chất, sắc tố
melanoid, sắc tố khuẩn lạc.
1.2.3.Phân loại Streptomyces
Chi Streptomyces bao gồm một số lượng lớn các xạ khuẩn có khả năng
sinh tổng hợp ra các kháng sinh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác
nhau .Việc phân loại và xác định tờn xạ khuẩn là rất quan trọng. Có rất nhiều
khoỏ phõn loại Streptomyces khác nhau: phân loại theo Krasillkow, Waksman,
Gauze, Shirling & Gottlieb, ngoài ra cũn cú thể phân loại theo kiểu gen. Hội
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
nghị "Vi sinh vật thế giới lần X" (được tổ chức tại Mexico vào năm 1970) chọn
khoá phân loại của E.B.Shirling & Gottlieb làm khoá phân loại chính để phân
trưng và trên các môi trường chọn lọc.
Các phương pháp phân lập giống xạ khuẩn: phương pháp cấy dịch chiết
trên bề mặt thạch, phương pháp cấy đất trực tiếp trên bề mặt thạch đã chứa sẵn
VSV kiểm định, phương pháp làm giàu đất, phương pháp thêm kháng sinh vào
môi trường phân lập, phân lập VSV sinh kháng sinh chống ung thư.
1.3.3. Các phương pháp cải tạo giống
A. Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên:
Chọn lọc tự nhiên hay còn gọi là sàng lọc ngẫu nhiên là tuyển chọn lấy
những dạng chủng có những đặc tính sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất, xuất
hiện ngẫu nhiên do sự tác động của các điều kiện ngoại cảnh.
B.Đột biến nhân tạo
Đột biến nhân tạo là quá trình xử lý tế bào bằng các tác nhân gây đột
biến (lý, hóa, sinh học…). Các tác nhân này khi sử dụng với liều lượng thích
hợp sẽ giết chết hầu hết các VSV, những cá thể sống xót sẽ có sự biến đổi ở
NST, gây ra đột biến gen liên quan đến cấu trúc gen làm thay đổi 1 hay nhiều
nucleotit trong trình tự mã hóa gọi là đột biến điểm. Đây là loại đột biến có ý
nghĩa trong công nghiệp kháng sinh, làm thay đổi tính trạng cũng có thể dẫn
đến làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính), hay tăng cường.
*ánh sáng UV khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV có kích
thước nhỏ (0,3-3
μ
m) thì nó có thể xuyên thấu tới nhân. Vì vậy được dùng phố
biến trong đột biến cải tạo giống.
*Cơ chế: Tia UV tác dụng lên ADN và mạnh nhất ở vùng 260nm gây
dime hóa thymin (do làm đứt các liên kết hyđro trong mạch kép ADN của tế
bào VSV). Mà thymin gần nhau liên kết cộng hóa trị với nhau ở C
5
và C
6
. Hậu
thuật cần thiết để giữ cho giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di
truyền ổn định và không bị tạp nhiễm bởi các VSV khác.
Có rất nhiều phương pháp giữ giống VSV khác nhau. Tùy vào loại VSV
để chúng ta chọn phương pháp giữ giống cho phù hợp. Đối với giữ giống xạ
khuẩn trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng phương pháp giữ giống trên môi
trường thạch nghiêng để trong tủ lạnh 2
0
C.
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
1.4. Dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy [5]
Trong quá trình sống, tế bào VSV luôn luôn phải trao đổi chất với môi
trường xung quanh. Tế bào VSV tuy rất nhỏ nhưng vì hấp thu các chất dinh
dưỡng và thải các sản phẩm chất qua toàn bộ bề mặt, cho nên cường độ trao đổi
chất của chúng là rất lớn. Các chất dinh dưỡng qua màng vào tế bào và được
chuyển hóa thành những chất riêng biệt cho việc xây dựng tế bào. Nhờ quá
trình đồng hóa và dị hóa các tế bào mới có thể phát triển, sinh trưởng, đồng thời
tạo ra các sản phẩm trao đổi chất.
Những VSV dùng trong công nghiệp vi sinh kháng sinh đều là các VSV
dị dưỡng. Để phát triển VSV cần một lượng đầy đủ các nguyên tố C, H, O, N,
P… và một trong những nguyên tố vi lượng là Mn, Mo, Zn, Cu… Môi
trường dinh dưỡng phải chứa tất cả các nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng và
tạo thành sản phẩm của VSV. Thông thường các môi trường nuôi cấy sử dụng
nước máy thì không cần phải bổ sung các nguyên tố vi lượng vì các chất này đã
có đủ trong các cơ chất dinh dưỡng ở dạng tạp chất. Trong quá trình lên men
người ta có thể thêm một số nguyên tố vi lượng đặc biệt hoặc tiền chất là chất
đặc hiệu cho sản phẩm tạo thành như tiền chất axít phenoxyacetic trong quá
trình lên men sản xuất penicillin V. ở đây cũng cần lưu ý, một môi trường nuôi
cấy thuận lợi cho sự phát triển của một VSV không nhất thiết sẽ là môi trường
đảm bảo cho sản xuất sản phẩm trao đổi chất tốt nhất. Môi trường lên men tốt
khó cơ giới hóa và tự động hóa. Chính vì lý do đó mà ngày nay, công nghiệp
kháng sinh không áp dụng lên men bề mặt trong sản xuất mà chỉ áp dụng trong
các phòng thí nghiệm để chọn giống.
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
* Phương pháp lên men chìm:
Phương pháp lên men chìm là kiểu lên men mà VSV phát triển trong
không gian 3 chiều của môi trường lỏng
Trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống
- Giống cấp 1: Nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100ml/500ml),
- Giống cấp 2: Nuôi cấy trong bình giống 80l,
- Giống cấp 3: Nuôi cấy trong bình 1-5m
3
.
Tỷ lệ giống trong môi trường là 1-10%. Tỷ lệ giống phụ thuộc vào quy
mô của bình lên men.
Quá trình lên men có thể làm thay đổi các điều kiện ban đầu của môi
trường: thay đổi pH, nồng độ các thành phần trong môi trường, các sản phẩm
trao đổi chất, tạo bọt trên bề mặt môi trường. Để đảm bảo những điều kiện tối
ưu cho sự phát triển của VSV trong quá trình lên men người ta đã đưa ra một số
biện pháp như: cho thêm các chất phá bọt (mỡ cá voi, dầu thực vật, chất điều
chỉnh pH hay dùng hệ đệm để ổn định pH). Cũng có thể lấy mẫu dịch lên men
phân tích để đánh giá các tham số và có sự điều chỉnh (nếu cần) quá trình lên
men .
- ưu điểm của phương pháp lên men chìm là:
+ Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu sinh lý
của VSV,
+ Hệ số sử dụng không gian cao (3 chiều), hiệu suất lên men cao,
+ Các thiết bị dễ cơ giới hóa, tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ít
nhân công.
Trong khi lên men, do nồng độ cao của một số chất (glucoza, các hợp chất
nitơ…) ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Bởi vậy khi bắt đầu
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
lên men các thành phần đó được đưa vào với một nồng độ thấp và được bổ
sung vào hệ thống trong quá trình lên men.
- Lên men liên tục: quá trình lên men môi trường dinh dưỡng được bổ
sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lên
men. Quá trình này xem như một hệ mở.
- Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men việc bổ sung thêm môi
trường dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không xảy ra liên tục mà
định kỳ sau những khoảng thời gian xác định.
1.6. Tách chiết và tinh chế [4][7]
Trong hầu hết các trường hợp thì sản phẩm đích (kháng sinh) chỉ là một
lượng rất nhỏ trong tổng số dịch lên men (0,2-30g/l). Kháng sinh là sản phẩm
trao đổi chất thứ cấp, do đó kết thúc quá trình lên men kháng sinh có thể nằm
trong sinh khối (ví dụ: gramicidin, nystatin) hoặc trong dịch lọc (ví dụ:
penixilin, streptomycin) tùy thuộc vào đặc điểm của loài. Vì vậy phải chiết tách
để lấy kháng sinh. Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào bản chất của
kháng sinh.
Một số phương pháp tách chiết hay được sử dụng:
- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ,
- Phương pháp kết tủa,
- Phương pháp dùng nhựa trao đổi ion.
Dù lựa chọn phương pháp nào thì mục đích cuối cùng vẫn là thu được
một sản phẩm kháng sinh có độ tinh khiết cao. Trong công nghiệp sản xuất
kháng sinh thường áp dụng một số phương pháp chiết tách và tinh chế như: lọc,
chiết, hấp thụ và sắc ký.
1.6.1. Chiết xuất
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Nguyên tắc: Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp phụ
(là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ), ở
đây pha tĩnh là chất rắn, pha động là dung môi. Chọn dung môi và chất hấp phụ
tùy thuộc vào chất cần xác định, nếu chất cần xác định không phân cực thì chọn
chất hấp phụ có hoạt tính cao (hấp phụ mạnh) và dung môi là không hay ít phân
cực. Chất phân cực ta chọn ngược lại.
- Sắc ký trao đổi ion:
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong
dung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit.
Nhựa có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổi
anion gọi là anionit. Quá trình trao đổi tuân theo định luật tác dụng khối lượng.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
Nguyên tắc: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố
khác nhau của các chất giữa hai pha. Pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành
tấm phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ 10
mm) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha
tĩnh.
* Cô đặc: Sản phẩm trao đổi chất ở nồng độ thấp cần phải cô lại trong
chân không trước khi kết tinh.
* Kết tinh: Kết tinh ở nhiệt độ thấp trên cơ sở độ tan của các chất thường
giảm theo nhiệt độ.
* Sấy khô: Có nhiều phương pháp sấy trên cơ sở dùng nhiệt độ cao, độ
thoáng khí hoặc hút.
* Nghiền vỡ tế bào VSV: Trường hợp kháng sinh là sản phẩm trao đổi
chất nội bào, để thu được kháng sinh cần phá vỡ tế bào VSV, có thể dùng
phương pháp vật lý, hóa học hoặc sinh học.
1.7. Một số nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh [12][13][16][17].
1.7.1. Kháng sinh Boromycin chống HIV từ xạ khuẩn
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces
hygroscopicus
Geldanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon gần đây đã được sự thu
hút bởi những đặc tính dược lý học của nó như: ức chế tạo thành tiểu cầu, ức
chế enzym sao mã ngược, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung
thư… với nồng độ ức chế tối thiểu (IC
50
) là 13nM khi tiến hành test với dòng tế
bào NCI. Đặc tính kháng ung thư của geldanamycin do ức chế mạnh ATP, làm
bất hoạt sinh tổng hợp protein của tế bào gây ung thư. Các nghiên cứu cũng cho
thấy sử dụng geldanamycin để điều trị ung thư sẽ tăng tính hiệu quả của phư-
ơng pháp điều trị đồng thời, ví dụ: xạ trị. Hiện nay, gendanamycin đang ở trong
giai đoạn 2 giám sát lâm sàng.
Gendanamycin được sinh tổng hợp bởi Streptomyces hygroscopicus
var.geldanus, trong quá trình sinh tổng hợp còn tạo ra 4,5-Epoxy-8-demethyl
geldanamycin, được tinh chế từ dịch lên men bằng sắc ký cột và sắc ký lỏng
hiệu năng cao.
Streptomyces hygroscopicus var.geldanus được lên men trên môi trường
YPD, pH được điều chỉnh ở 6,5 bằng H
2
SO
4
2,5N hoặc NaOH 2,5N, cấp khí
bằng hỗn hợp khí chứa oxy hoà tan là 30%.
Tinh chế hai thành phần trên bằng phơng pháp sắc ký cột HP20, dịch rửa
giải là MeOH.
Gendanamycin và 4,5-Epoxy-8-demethylgeldanamycin là những kháng
sinh có khả năng ứng dụng cao đối với mô hình bệnh tật hiện nay được sinh
tổng hợp từ Streptomyces sp.
1.7.4. Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase từ
dịch lọc sau nuôi cấy 10 ngày ở 30
0
C được tinh chế bằng cột Diaion HP20, rửa
giải bằng MeOH và Aceton được gộp lại và làm bốc hơi dưới áp suất giảm, sau
đó tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, dung môi rửa giả là n-hexan (1), n-hexan:
ethylacetate =3:7 (2), n-hexan: acetone = 3:7 (3), và acetone (4).
Tetrapetalone B được tìm thấy ở phân đoạn dung môi (1) và (2) , sau đó
sắc khí trao đổi ion bằng cột Sephadex LH – 20, dung môi rửa giả là MeOH,
tinh chế phân đoạn dung môi (1) thu được 10mg bột từ 7,2l môi trường
Tetrapetalone A có IC
50
là 190 (
μ
M)
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Copyright: Tài liệu đại học ©