2. Phương pháp mẫu dò lạnh (cold probe)
Trước đây các phương pháp lai đều sử dụng mẫu dò đánh dấu
phóng xạ. Về sau thay vì chế tác và sử dụng những mẫu dò phóng xạ
người ta kết hợp kháng thể với enzyme và lợi dụng hoạt tính của enzyme
để phát màu cơ chất giúp phát hiện băng đặc hiệu, được gọi là phương
pháp mẫu dò lạnh. Nhìn chung phương pháp sử dụng mẫu dò lạnh có độ
phiền phức và mất thời gian tương tự phương pháp sử dụng mẫu dò phóng
xạ. Trong trường hợp này tính bổ sung giữa mẫu dò với DNA tế bào trở
nên giảm nên các bước rửa cần phải nhẹ nhàng. Nếu sử dụng các mẫu dò
phóng xạ thì việc kiểm tra chất lượng nền trong quá trình rửa thực hiện
được nhờ máy đo phóng xạ rất dễ dàng, và nếu rửa chưa đủ nên nền còn độ
phóng xạ cao thì tiếp tục rửa cho đến khi nền giảm xạ. Phương pháp mẫu
dò lạnh không có ưu điểm này, phải thực hiện chọn đến khi phát màu. Ví
dụ dưới đây mô tả phương pháp mẫu dò lạnh với probe của hãng
Amersham Life Science gọi là phương pháp ECL.
1 6 1
Trong trường hợp này probe được kết hợp trực tiếp với enzyme và
kiểm xuất trên film sự phát huỳnh quang của tổ hợp do phản ứng hóa học
phát ra. Thời gian lộ quang khoảng 1 giờ (trong lúc này một tấm
Hyperfilm được đặt ép lên màng Saran wrap phủ trên màng đang phản
ứng, sau đó rửa film và đọc kết quả. Phương pháp này đơn giản, thực hiện
và đọc thuyết minh một cách dễ dàng. Người ta cũng đã sử dụng vào việc
giám biệt quan hệ huyết thống (tìm bố thực hay bố sinh học cho con ). Từ
các làn DNA của hai người bố cũng như của người mẹ có khoảng 10 băng
nhìn thấy rõ và 5 - 6 băng mờ hơn. Trong các băng đó có khá nhiều băng
có sự khác biệt về độ lớn, nhờ vậy hình thành dấu "vân tay" DNA rất riêng
biệt của cá thể. Có thể nhìn thấy đồng thời tính đa hình các đoạn hạn chế
của nhiều đoạn DNA.
Tuy nhiên, nếu quan sát kỹ các băng trong dấu "vân tay" DNA thì
nhất định thấy một số băng của làn DNA của người con có độ dài tương tự
1 6 2

5) Điện di với dung dịch đệm TBE, không cần nhuộm ethidium bromide.
6) Làm biến tính (phương pháp kiềm, sau đó trung hòa).
7) Chuyển qua màng (nylon, nitrocellulose). Có thể tăng sự cố định DNA
trên màng bằng cách để khoảng 4 - 5 cm dưới một đèn tử ngoại và chiếu tử
ngoại 3 phút. Làm khô (với phương pháp làm khô nhanh thì tốt).
8) Lai tiền khởi (khoảng 1 - 3 giờ ở khoảng 35 ºC, nhiệt độ cao hay thấp
được tính tùy theo độ dài mẫu dò và tỷ lệ G+C trong đó).
9) Lai với mẫu dò minisatellite đánh dấu enzyme (khoảng 10 giờ hay qua
đêm ở khoảng 35 ºC).
10) Rửa màng bằng TBE, thay dịch rửa một số lần.
11) Không làm khô màng, cho màng vào túi polyethylene rồi thêm vào đó
dịch cơ chất màu (ECL, cũng có thể CDP-Star, hãng Amersham) tương
ứng với enzyme. Hàn kín các cạnh của túi bằng máy ép gia nhiệt.
1 6 3
12) Đưa vào buồng tối để hiện hình, ép một tấm Hyperfilm lên màng. Để
tự ký qua đêm ở −20 hay −70 ºC. Rửa hiện ảnh trên film. Hong khô film.
Đọc và phân tích kết quả.
Chú ý: Thuộc nhóm mẫu dò quang hóa học (Chemilluminescent
probe) này còn có LumiGLO của hãng Cruachem Inc., CSPD của hãng
ICN Pharmaceuticals
1 6 4
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phạm Thành Hổ 2000. Di truyền học. Nxb Giáo dục, Hà Nội.
2. Applied Biosystems, Inco. 1991. High-quality template DNA for Taq Cycle
Sequencing Using DyedeoxyTM Terminator: An improved preparation
procedure. DNA sequencing Model 373A User Bulletin 18.1-4.
3. Birnboim H. C. & Doly J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for
screening recombinant plasmid DNA. Nucleic acids Res. 7: 1513-1523.
4. Cann A. J. 2001. Principles of molecular virology, 3rd ed. Academic Press,
London.

3. Thu hồi đoạn DNA từ gel điện di 15
III. Chiết suất bằng phenol 19
1. Chế phenol 19
2. Chiết xuất phenol và chlorform 20
IV. Cô đặc và thẩm tích 21
1. Cô đặc 21
2. Thẩm tích 22
V. Phương pháp định lượng acid nucleic (DNA và RNA) 24
1. Phương pháp quang học 24
2. Phương pháp định lượng bằng điện di 24
3. Phương pháp nhỏ giọt định lượng acid nucleic 25
Chương 2. Kỹ thuật cơ bản trong tái tổ hợp DNA 26
I. Điều chế DNA plasmid 26
1. Điều chế lượng nhỏ DNA plasmid 26
1.1.Phương pháp Birnboim 26
1.2. Phương pháp đun sôi 28
2. Điều chế lượng lớn DNA plasmid 28
2.1. Nuôi cấy vi khuẩn 28
2.2. Chiết xuất DNA 29
2.3. Điều chế plasmid bằng li tâm phân đoạn trong mật độ cesium
chloride (CsCl) 29
II. Điều chế DNA phage λ
32
1. Phương pháp xác định hiệu giá phage 32
2. Điều chế lượng nhỏ DNA phage 32
1 6 6
2.1. Phương pháp điều chế dịch phage dung khuẩn 33
2.2. Điều chế lượng nhỏ DNA phage 33
3. Điều chế lượng lớn DNA phage 34
3.1. Phương pháp chế dịch phage dung khuẩn 34

VIII. Tạo tế bào khả biến hay chịu di nạp (competent cell) 75
1. Phương pháp CaCl
2
75
2. Phương pháp Hanahan 76
3. Sử dụng tế bào khả biến 77
IX. Subcloning (tái tạo dòng thuần) 78
1. Điều chế vector plasmid 78
2. Điều chế DNA cần gắn 78
1 6 7
X. Phân tích điều tiết phiên mã nhờ thử nghiệm CAT (CAT
assay) 81
1. Thí nghiệm chính: di nạp gen vào tế bào eukaryota 81
2. CAT assay 82
Chương 3. Kỹ thuật phân tích xác nhận phân tử 84
I. Kỹ thuật lai Southern (Southern hybridization) 84
1. Chuyển Southern (Southern transfer) 84
2. Lai (hybridization) 86
3. Lai gel khô 87
II. Lai Northern (Northern hybridization) và lai thẩm đốm (dot
blot hybridization) 90
1. Northern hybridization (biến tính RNA bằng formaldehyde) 90
2. Dot blot hybridization (sử dụng hydroxymethyl thủy ngân) 91
III. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA 93
1. Phương pháp dideoxy 94
1.1. Điều chế DNA khuôn 95
1.2. Điều chế dung dịch nucleotide cho phản ứng dideoxy 97
1.3. Gắn kết DNA khuôn với mồi 98
1.4. Phản ứng dideoxy 99
1.5. Sequencing gel (gel giải trình) 101

(DMS) 127
IX. Phương pháp "vết chân" (foot print) nhờ DNase I 128
X. Phân tích protein 130
1. Định lượng protein (phương pháp Bradford) 130
1.1. Điều chế các hóa chất 130
1.2. Định lượng 130
2. Điện di SDS-polyacrylamide 130
2.1. Chế tác gel SDS-polyacrylamide 131
2.2. Điều chế mẫu, điện di và nhuộm 131
3. Phương pháp thẩm Western 133
3.1. Blotting 133
3.2. Nhuộm bằng kháng thể 134
XI. Tinh chế protein kết hợp DNA nhờ sử dụng trình tự DNA
đặc hiệu 136
1. Điều chế DNA 136
2. Kết hợp DNA với sepharose đã được hoạt hóa bởi CNBr 137
3. Tinh chế protein bằng cột Sepharose đã kết hợp DNA có trình
tự base đặc hiệu 138
XII. South-Western hybridazation 139
1. Điều chế dịch chiết xuất tế bào 139
2. Phương pháp South-Western blot (thẩm South-Western) 140
XIII. Phương pháp tạo thể đột biến nhân tạo 141
1. Chế tác thể đột biến khuyết tổn 141
1.1. Tiêu hóa từng phần bằng Bal 31 142
1.2. Tạo dòng phụ (subcloning) đoạn khuyết tổn 143
2. Chế tác thể đột biến vị trí chỉ định 144
2.1. Phương pháp sử dụng DNA tổng hợp làm mồi 144
2.2. Phương pháp sử dụng DNA tổng hợp như đoạn ghép (phương
pháp biến dị cassette) 149
XIV. PCR 151