1ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
BÁO CÁO THỰC HÀNH
KỸ THUẬT DI TRUYỀN VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ
Nhóm 1
Giảng viên: TS. Nguyễn Huy Thuần
Họ và tên sinh viên: Đỗ Thị Hào
MSSV: DTN1153150024
Lớp: 43 CNSH
Khoa: CNSH& CNTP

Thái Nguyên, 2013

2


O): 0,58448 g
+ NaCl: 8,14 g
+ H
2
O: 100 ml
+ β-mercaptoethanol: 0,2 ml (chỉ bổ sung ngay trước khi sử dụng)

3
Dung dịch đệm CTAB có tác dụng phá màng tế bào , bào quan, giải phóng
ra DNA.
EDTA có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme DNase, bảo vệ DNA, phá
vỡ liên kết hóa trị II và do đó làm giảm tính bền vững của lớp màng ngoài
tế bào vi khuẩn.

- Dung dịch CIAA:
+ 24 ml chloroform
+ 1 ml isoamylalcohol
Chloroform không tan trong nước, do đó khi bổ sung vào dịch nuôi tế
bào sẽ làm cho dịch này phân thành 2 lớp( pha). Hỗn hợp ly tâm
mạnh để phân tách lớp. Protein bị kết tủa sẽ nằm ở pha giữa.
Isoamylancohol là 1 ancohol với sự có mặt của cation hóa trị I ( NA
+
,
K
+
, NH
4
+
) có tác dụng làm kết tủa DNA.


phương pháp 1. Do tác giả Gawel và cộng sự đưa ra năm 1991 và đã có sự cải
tiến.
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở sử dụng kết hợp cơ học là
nghiền và các hóa chất để phá vỡ vật liệu ban đầu là màng nhân, tạo thành hỗn
hợp đựng trong các ống Ependorp. Đồng thời kết hợp ly tâm để tách, các hóa
chất và loại bỏ những thành phần không mong muốn, từ đó thu nhận DNA.
3.2. Quy trình tách DNA (Gồm 10 bước)
A. Bước 1: Bước chuẩn bị mẫu
Lấy 1.5 ml dịch nuôi vi khuẩn E. coli cho vào ống eppendoft 1.5 ml. Ly
tâm 5000 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi để thu sinh khối tế bào. Lưu ý trình tự của
các mẫu phải sắp xếp phù hợp với số ống eppendorp (phần sau gọi là ống mẫu).
Đánh số thứ tự trên eppendorp bằng bút dạ không bị nhòe bởi nước theo thứ tự
mẫu (hình 4).
B. Bước 2: Tách DNA, loại bỏ protein và các thành phần không mong
muốn.
+ Bổ sung vào eppendorf chứa mẫu đã nghiền 500 µl dung dịch đệm CTAB,
đảo trộn đều mẫu bằng máy vortex sao cho mẫu tan đều trong dung dịch đệm. Sau
đó ủ ở 60
o
C trong 1h bằng máy lắc ổn nhiệt (hình 5). Nếu trường hợp không có
máy lắc ổn nhiệt thì ủ mẫu trong 60
o
C trong 1 h, cứ 10 lại lấy ra đảo trộn đều 1 lần
bằng máy vortex.
+ Sau 1 h, lấy eppendorf chứa mẫu ra, ly tâm nhẹ để toàn bộ dung dịch lắng
xuống đáy ống. Sau đó bổ sung 500 µl dung dịch CIAA, đảo trộn bằng máy
vortex trong vòng 30 giây.
+ Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
Chú ý: đặt eppendorf phải đối xứng nhau trong máy ly tâm (hình 6). Trong
trường hợp số lượng ống eppendorf lẻ, cần phải thêm 1 ống khác có trọng lượng

đặt eppendorf vào máy ly tâm rồi ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút để
toàn bộ phần dung dịch bám trên thành ống di chuyển xuống phía đáy ống
rồi hút loại bỏ hoàn toàn phần dung dịch.
D. Rửa kết tủa DNA.
+ Bổ sung vào eppendorf 1000 µl dung dịch cồn 70% rồi đảo trộn
mạnh bằng máy vortex sao cho phần cặn DNA long ra khỏi đáy ống.
+ Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Dùng micropipette 200 µl
hút loại bỏ hoàn toàn dung dịch cồn 70% ra khỏi ống. Ly tâm ống 10.000
vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ hoàn toàn dung dịch cồn 70% khỏi ống
lần 2.
+ Mở nắp eppendorf rồi để khô tự nhiên kết tủa DNA cho đến khi
trong eppendorf không còn mùi cồn và khô hoàn toàn (khoảng 10-15
phút) ở nơi sạch, thoáng, không có người qua lại. Tốt nhất là để khô tự
nhiên kết tủa DNA trong tủ Hood.
E. Hòa tan DNA

6
+ Bổ sung vào eppendorf chứa kết tủa DNA 100 µl dung dịch đệm TE
1x. rồi đảo trộn bằng máy vortex. Ủ eppendorf ở 70
o
C trong 10 phút trên
máy lắc ổn nhiệt.
F. Kiểm tra sản phẩm tách chiết bằng điện di trên gel agaro
Kết quả thu được của nhóm 1:

Hình 1: Điện di tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn E.coli
Nhận xét:
Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, không có DNA bị đứt
gãy, tuy nhiên lượng DNA thu được ít nên vạch không sáng rõ, còn mờ, ngoài ra
vẫn còn tạp chất như protein, không bị lẫn RNA, mẫu số 6 thành công nhất, sau


- Giếng số 8: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch
gọn nhỏ, lượng DNA thu được ít,( hình ảnh bị mờ nên không
nhận xét được DNA có bị đứt gãy không), ngoài ra bị lẫn tạp
chất protein bị dính ở miệng và giếng và RNA ở cuối đường
chạy điện di.

- Giếng số 9: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch
gọn nhỏ, lượng DNA thu được ít,( hình ảnh bị mờ nên không
nhận xét được DNA có bị đứt gãy không), ngoài ra bị lẫn tạp
chất protein khá nhiều bị dính ở miệng giếng, tuy nhiên giếng
9 không bị lẫn RNA.
IV. Giải thích
Nguyên lí của quá trình tách chiết phá vỡ tế bào vi khuẩn E.coli:
- Phá vỡ tế bào , màng tế bào và mô.
- Loại bỏ tạp chất không phải DNA ( Protein, lipid, đường…)
- Phá vỡ tế bào bằng cách xử lí nhiệt, dung lực mạnh hơn để
phá vỡ liên kết, lực cơ học đảo trộn bằng máy vortex.
- CTAB : Chất tẩy rửa thường dùng để phá vỡ màng tế bào,
bào mòn màng tế bào. Màng tế bào là lớp kép phospholipid,
CTAB làm biến tính protein, phospholipid bị hòa tan.
Trong dung dịch đệm có các thành phần:
- Tris- HCl: ổn định pH.

8
- EDTA: Có ái lực cao với ion kim loại hóa trị II hấp thụ kim
loại nặng, bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của enzyme DNase,
enzyme nội bào hấp thụ Ca
+
, Mg

- Rửa tủa bằng cồn 70%, không sử dụng nước cất để rửa để rửa
tủa vì DNA bị hòa tan trong nước không hòa tan trong cồn.
Nếu tủa lẫn muối : Muối hòa tan trong cồn 70%, cồn 100%
muối không tan, cồn kết tủa cả protein vì cậy khi rửa tủa bằng
cồn xong thì hút hết hết cồn và làm bay hơi hết cồn. Nếu còn
cồn sẽ làm biến tính enzyme không thực hiện được các phản
ứng sinh học phân tử tiếp theo.
- Hòa tan DNA bằng TE 1X hoặc nước khử ion, nước khử ion
và TE 1X đều có thể hòa tan tủa DNA nhưng ít khi sử dụng
nước khử ion vì rửa tủa bằng TE 1X hiệu quả hơn có thể bảo
quản được lâu, TE bảo quản tốt nhất vì có chứa EDTA ái lực
với ion kim loại hóa trị II, bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của
enzyme giúp bảo quản được lâu.
Hạn chế của TE là khi có sự có mặt của EDTA ức chế các
enzyme các phản ứng sinh học phân tử sau này. Cho nên sử
dụng TE ở nồng độ loãng, nếu không sẽ ức chế các phản ứng
sinh học sau này.
Sử dụng TE 1X là được.

9
Bài 2
XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ DNA BẰNG QUANG PHỔ KẾ

I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
Mục đích
Phương pháp định lượng acid nucleic được sử dụng phổ biến nhất là
phương pháp quang phổ do tính tiện dụng và chỉ số tin cậy ở mức cho phép.

Bước 4: Đo OD bằng máy
- Chọn chế độ đo OD 260/280
- Đưa cuvet blank vào, chuẩn hóa
- Lần lượt đưa cuvet 1,2,3 vào và đo OD, ghi lại kết quả
Bước 5: Tính toán và kết luận
- Từ số liệu thu được, tính toán nồng độ DNA trong dung dịch gốc
bằng cách nhân với 1000.
- Dựng đường chuẩn với 3 điểm
- Kết luận về độ sạch của DNA dựa trên chỉ số OD260/280.
IV. Nhận xét: Đã sử dụng mẫu 16 ( tách DNA tổng số khá
thành công) để tiến hành trong bài này , tuy nhiên do nhân tố chủ
quan nên mẫu không cho được kết quả.

11
Bài 3
ĐIỆN DI TRONG GEL AGAROSE

I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
Mục đích
Điện di DNA trong gel agarose là kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng
và hàm lượng DNA. Kỹ thuật dựa trên nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của
axít nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu
tác động của một điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường.
II. THIẾT BỊ, HÓA CHẤT
2.1 Thiết bị, dụng cụ
- Bộ điện di DNA: Nguồn điện di (80 - 120V), giá và bể điện di, lược tạo
giếng điện di, khay thăng bằng nhờ giọt nước đổ bản gel.
- Cân điện tử
- Bình chịu nhiệt để đun agarose
- Lò vi sóng

- Bước 1: Pha 0,8 gam agarose trong 100 ml TAE 1X, đun sôi bằng lò vi
sóng. Lưu ý khi đun bằng bình chịu nhiệt có nắp không được đậy nắp kín, hoặc
đun bằng cốc thủy tinh chỉ nên đổ khoảng 2 phần 3 thể tích cốc nhằm tránh tràn
khi sôi. Đun sôi để nguội đến 60
o
C (khi có thể dùng tai cầm được bình đựng
agarose là được) mới tiến hành đổ bản gel.
- Bước 2: Trước khi đổ bản gel cần lau sạch giá đổ bằng giấy thấm mềm
dễ hút nước sau đó mới cài lược. Lược tạo giếng được đặt ở phía cực âm của bể
điện di. Tiến hành cân bằng mặt phẳng của giá bể bằng giọt nước trên giá .
Đổ bản gel, bản gel trong bài thực hành này có kích thước dài 10 cm,
rộng 6,5 cm và cao 0,4 cm. Mỗi giếng sâu 0,3 cm, thể tích giếng chứa được 0,8
μl mẫu. Do vậy mỗi bản gel cần đổ 50 ml. Đợi khoảng 1 giờ cho khô và tháo
lược (hình 9 và 10).
- Bước 3: Đổ khoảng 150 ml dung dịch TAE 1X vào bể điện di, dung
tích TAE có thể linh động thay đổi để phù hợp khi đặt bản gel trong bể.
- Bước 4: Đặt bản gel (hình 10) vào bể điện di, lưu ý có thể thêm hay bớt
dung dịch TAE 1X, để được bản gel ngập 0,1 cm (1mm) so với bề mặt dung
dịch điện di.
- Bước 5: Lấy 10 μl ở các mẫu DNA đã tách chiết trộn với 2μl Dye 6X
bằng các ống eppendorp mới (đã ghi thứ tự), vẩy nhẹ tay để mẫu DNA được trộn
đều với Dye 6X. Cho cẩn thận hỗn hợp 8μl ở ống vào giếng điện di bằng

13
micropipet. Ghi chép lại thứ tự của ống mẫu tương ứng với thứ tự của giếng.
Mỗi ống mẫu được dùng một đầu côn hút riêng. Khi tra mẫu vào giếng, một tay
tỳ lên thành giá của điện di làm điểm dựa, tay kia đưa micropipet sao cho đầu
côn vừa sát miệng giếng rồi bơm từ micropipet ra. Cần lưu ý thao tác này nếu
không cẩn thận sẽ làm tràn ra ngoài giếng hoặc vỡ miệng giếng .
- Bước 6: Chạy điện di ở điện thế 100V trong 30 phút (hình 12). Lúc này

KỸ THUẬT PCR I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
Mục đích
PCR (Polymerase Chain Reaction) lần đầu tiên được Karl Mulis mô tả năm
1984. Phản ứng chuỗi polymerase là một kỹ thuật đơn giản cho phép nhân bản nhanh
một trình tự DNA lên rất nhiều lần trong vài giờ. PCR được thực hiện khi có khuôn,
Taq-polymerase, các mồi chuyên biệt gồm, bốn loại deoxy-ribonucleotide
triphotphate (dNTP), dung dịch đệm và ion Mg
2+
. PCR là một công cụ hữu hiệu cho
việc phân tích gen, vì nó có khả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự DNA đặc hiệu
từ bất kỳ cơ thể nào.
II. DỤNG CỤ HÓA CHẤT
2.1. Dụng cụ
- Lò vi sóng
- Cân điện tử
- Bình chịu nhiệt 500 ml
- Ống PCR
- Máy ly tâm
- Máy lắc
- Máy PCR
- Bộ điện di
- Máy soi gen
2.1. Hóa chất và các thành phần của phản ứng PCR
- Enzyme Taq polymerase
- Buffer PCR
- MgCl
2

Primer F 1,0
4
Primer R 1,0
5
100 µM dNTPs 1,5
6
5U DNA taq polymerase 0,2
7
DNA khuôn 2,0
8
H
2
O khử ion 15,3
Tổng
25 Bước 2: Chạy PCR khuếch đại vùng trình tự gen mục tiêu
Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau:
- Biến tính ban đầu: 94
o
C trong 5 phút
- Khuếch đại: 35 chu kỳ gồm các bước:

16
+ Biến tính: 94
o
C trong 30 giây
+ Gắn mồi: 55
o

17
Bài 5
TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR
I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
Mục đích
Sản phẩm PCR của bài 5 sẽ được dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Điều kiện tiên quyết của sản phẩm PCR là phải sạch, không lẫn các sản phẩm
phụ và không còn sót các thành phần khác của PCR như enzyme, muối, dNTP
Bài thực hành này sẽ thực hiện thao tác tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương
pháp cho qua cột.
II. CÁCH TIẾN HÀNH
3.1. Nguyên tắc
Một số thí nghiệm như giải trình tự gene cần nguồn DNA có độ tinh khiết
cao. Tinh sạch qua cột là cách làm phổ biến nhất để đáp ứng yêu cầu này. Bài
thực hành này dựa trên nguyên lý sắc ký chọn lọc kích thước. Dung dịch chứa
DNA hòa tan chảy qua một mạng lưới cấu tạo bởi các lỗ nhỏ và các hạt hấp thụ.
Các phân tử nhỏ như muối và các nucleotide riêng lẻ sẽ chui vào trong các hạt
hấp thụ, còn các phân tử lớn như các phân đoạn acid nucleic sẽ đi qua các lỗ.
Đây là một phương pháp khá nhanh và đơn giản để tinh sạch acid nucleic.

3.2. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR
Bước 1: Chuẩn bị mẫu và cột
- Bổ sung 5 lần thể tích Buffer PB vào 1 thể tích sản phẩm PCR. Trộn
đều bằng pipet. Ví dụ: bổ sung 200µl Buffer PB vào 20 µl sản phẩm
PCR.
- Đặt cột vào ống chứa 2 ml.
Bước 2: Bám DNA lên cột
- Chuyển hỗn hợp DNA ở bước 1 lên cột bằng micropipette 500 ml.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút.
- Loại bỏ dung dịch trong ống thu 2 ml.

thẳng.
II. DỤNG CỤ HÓA CHẤT
2.1. Dụng cụ
- Bể ổn nhiệt
- Ống eppendoft 1.5 ml
- Micropipet các loại
- Máy ly tâm
- Bộ điện di
- Máy soi gen
2.1. Hóa chất và các thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn
- Enzyme giới hạn ECoRI
- Buffer
- Plasmid pRSET
- Nước khử ion
- Và bao gồm toàn bộ các thành phần của bài điện di.
III. CÁCH TIẾN HÀNH
3.1. Nguyên lý
Endonuclease giới hạn hay còn gọi là enzyme giới hạn là những enzyme
có khả năng nhận biết một trình tự DNA đặc hiệu và phá vỡ liên kết
phosphodiester ngay tại đó. Enzyme giới hạn ECoRI có 1 vị trí nhận biết duy
nhất trên vector do đó khi cắt vector này sẽ bị chuyển từ dạng mạch vòng sang
dạng mạch thẳng và phân biệt được trên bản gel điện di. 20
3.2. Các bước thực hiện
- Bước 1: Trộn các thành phần đã nêu trên trong ống eppendorp loại 1.5 ml,
cho vào máy ly tâm ở tốc độ nhẹ (spin). Bước này nhằm để các thành phần nêu trên
lắng xuống đáy ống.
Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt enzyme HindIII: