CÔNG NGHỆ GENE
(GENETICS ENGENEERING)
Nguyễn Vũ Phong
Chương II
QUY TRÌNH TIẾN HÀNH
•
Bước 1: Nuôi tế bào chủ và tế
bào cho
•
Bước 2: Tách DNA plasmind và
DNA tế bào cho
•
Bước 3: Cắt DNA plasmid và
DNA mục tiêu
•
Bước 4: Nối 2 loại DNA bằng
enyme nối tạo DNA tái tổ hợp
hoàn chỉnh
•
Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp
vào tế bào nhận (thường là vi
khuẩn E.coli)
•
Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng
vi khuẩn mang gene tái tổ hợp
•
Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để
gene biểu hiện ra sản phẩm
1. Enzyme
1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE)
-

e
G
CTTAA
AATTC
G
EcoRI
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
G
CTTAA
AATTC
G
Ligation. (lige re = latin ‘to join’)
1. DNA Ligase reacts with an AMP donor in
an ATP (or NAD
+
dependent manner
depending on the source of ligase) 
activated enzyme.
2. Activated enzyme donates AMP to free
5’-PO
4
=
at the nick in the lower strand of
the DNA duplex, creating a high-energy
diphosphate group on one side of the
nick.

exonuclease 3’-5’
Taq polymerase DNA polymerase chịu nhiệt
1. Enzyme
2. Các vector chuyển gene
Plasmid:
-
DNA vòng tròn
-
Sao chép độc lập trong tế bào
-
Có khả năng mang một số gene có khả năng biểu hiện thành protein
Vector:
-
Có khả năng tự tái bản
-
Tồn tại độc lập trong tế bào
-
Mang được gene mong muốn
Yêu cầu đối với vector chuyển gene.
-
Có trình tự khởi đầu sao chép (ori)
-
Trình tự nhận biết cho RE
-
Trình tự điều hòa (promoter)
-
Đảm bảo sự di truyền bền vững của
DNA tái tổ hợp
-
Có gene đánh dấu (marker) để dễ

Mang được đoạn DNA
(15-23Kb)
-
Dùng trong thành lập
ngân hàng gene
2. Các vector chuyển gene
2.3. Cosmid :
-
Plasmid gắn thêm đoạn cos của
phage,
-
Có thể chứa đoạn gene dài đến
45kb
-
Dùng lập thư viện gen
2. Các vector chuyển gene
2.4. Phagemid
2.5. Phage M13:
-
DNA mạch đơn
-
Dùng xác định trình tự
nucleotide của gene
-
Sản xuất mẫu dò
(probe)
-
Gây đột biến điểm định
hướng (site-directed
mutagenesis)

derived artificial
chromosome)
3. Hệ thống tế bào chủ (Host)
Mục đích:
-
Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng.
-
Biểu hiện gene
-
Sản xuất protein tái tổ hợp.
3.1. Escherichia coli (E.coli)
-
Dễ nuôi cấy và nhân dòng
-
Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau.
-
Vi khuẩn Gram-, hình que,
-
Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base
3. Hệ thống tế bào chủ (Host)
3.2. Saccharomyces cerevisiae
-
Đối tượng nghiên cứu của vi sinh vật Eukaryote
-
Phân lập được nhiều promotor hoạt động mạnh
-
Thực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein có
đủ hoạt tính sinh học.
-
Sản xuất protein tái tổ hợp

Lai trên pha rắn
Southern blot, Northern blot, Western blot, Dot và slot blot
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
1. Lai nucleic acid
-
Lai trên pha rắn
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
Dot và slot blot
dùng cho RNA và DNA
1. Lai nucleic acid
-
Lai trên pha rắn
-
Lai tại chổ
(in situ hybridisation):
nghiên cứu nucleic acid tại
chổ không cần phải tách
chiết ra ngoài
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
2. Thu nhận gene
-
Thu nhận DNA từ bộ gene
* Shotgun
* Ngân hàng/thư viện DNA bộ gene (Bank/Library of genomic DNA)
-
Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học
-