BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
NGUYỄN PHƯỚC BẢO HOÀNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME
CELLULASE KỸ THUẬT TỪ XẠ KHUẨN VÀ ỨNG DỤNG
SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM BỘT RONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch
Mã số: 60. 54. 10
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS TRẦN THỊ LUYẾN
Khánh Hòa - 2012
ương nghiên cứu Trang ii
LỜI CẢM ƠN
ương nghiên cứu Trang iiii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu độc lập của riêng tôi dưới
sự hướng dẫn của GS.TS Trần Thị Luyến. Các số liệu và kết quả nghiên cứu
được nêu trong luận văn là trung thực, có trích dẫn nguồn gốc rõ ràng và chưa
từng được công bố trong bất cứ công trình nào khác.
Khánh Hòa, tháng 03 năm 2012
Tác giả luận văn Nguyễn Phước Bảo Hoàng
1.3.2. Các lĩnh vực ứng dụng cellulase 32
1.4. Rong Mứt 36
1.4.1. Giới thiệu chung 36
1.4.2. Hệ thống và đặc điểm phân loại rong Mứt 36
1.4.3. Tình hình chế biến và sử dụng thực phẩm được từ rong biển tại Việt Nam 39
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43
2.1. Đối tượng và hóa chất 43
2.1.1. Đối tượng 43
2.1.2. Hóa chất và thiết bị chuyên dụng 44
ương nghiên cứu Trang iviv
2.2. Phương pháp nghiên cứu 48
2.2.1. Phương pháp hóa sinh 48
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật 49
2.2.3. Phương pháp đánh giá phân tích 50
2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 51
2.3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu chính 51
2.3.2. Bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng xạ khuẩn và môi trường thích hợp sinh
tổng hợp enzyme cellulase 51
2.3.3. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi sinh
enzyme 54
2.4. Bố trí thí nghiệm thu nhận C-CPE từ dịch nuôi cấy 57
2.4.1. Lựa chọn tác nhân kết tủa 57
2.4.2. Lựa chọn nồng độ kết tủa 58
2.4.3. Xác định tính chất lý hóa của C-CPE 58
2.5. Thử nghiệm sản xuất bột rong thủy phân từ rong Mứt Porphyra vietnamensis 59
2.6. Phương pháp xử lý số liệu 64
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 65
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 101
Kết luận 101
Kiến nghị 101
TÀI LIỆU THAM KHẢO 102
PHỤ LỤC 106
Phụ lục 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ PHÂN TÍCH 106
Phụ lục 2. BẢNG KẾT QUẢ CÁC THÍ NGHIỆM 111
Phụ lục 3. MỘT SỐ DỤNG CỤ, THIẾT BỊ SỬ DỤNG 114
Phụ lục 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM 116 ương nghiên cứu Trang vivi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hàm lượng cellulose của các loại thực vật 13
Bảng 1.2. Phân nhóm VSV theo khả năng phát triển ở nhiệt độ khác nhau 25
Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng trong 100g rong Mứt 39
Bảng 2.1. Nhóm xạ khuẩn chi Micromonospora-VTCC 43
Bảng 2.2. Thành phần hóa học môi trường nuôi cấy 45
Bảng 2.3. Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm 47
Bảng 3.1. Định tính cellulase của 3 chủng Micromonospora sau 3 ngày 65
Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 3 chủng Micromonospora sau 3 ngày 67
Bảng 3.3. Mô tả đặc điểm sinh lý hóa Micromonospora VTCC-A-1787 68
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của
chủng MicromonosporaVTCC-A-1787 77
Hình 1-10. Cơ chế tác dụng của hệ enzyme cellulase lên cellulose 19
Hình 1-11. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase 20
Hình 1-12. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) 21
Hình 1-13. Các loại rong Mứt phổ biến tại Việt Nam 37
Hình 2-1. Các chủng xạ khuẩn Micromonospora VTCC 43
Hình 2-2. Hình dáng rong Mứt Porphyra vietnamensis 44
Hình 2-3. Rong Mứt Porphyra vietnamensis tươi 44
Hình 2-4. Các nguyên liệu bổ sung vào môi trường nuôi cấy 45
Hình 2-5. Quá trình định tính cellulase 48
Hình 2-6. Đường chuẩn glucose theo phương pháp so màu 49
Hình 2.7. Mẫu rong mứt tươi Porphyra vietnamensis 61
Hình 2.8. Mẫu rong Mứt Porphyra vietnamensis khô sau khi xử lý 61
Hình 2.9. Mẫu rong ngâm xử lý CH
3
COOH 1% 62
Hình 2.10. Bột rong Mứt nguyên liệu 63
Hình 3-1. Vòng phân giải cơ chất của chủng Micromonospora sau 3 ngày 66
Hình 3-2. Khuẩn lạc Micromonospora VTCC-A-1787 67
Hình 3-3. Khả năng lên men đường của Micromonospora VTCC-A-1787 68
Hình 3-4. Đường cong sinh trưởng của Micromonospora VTCC-A-1787 69
Hình 3-5. Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy đến hoạt tính cellulase của chủng Micromonospora
VTCC-A-1787 71
ương nghiên cứu Trang viiiviii
Hình 3-6. Vòng phân giải cơ chất CMC theo thời gian 72
Hình 3-7. Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo thời gian của chủng
Micromonospora VTCC-A-1787 73
Hình 3-8. Ảnh hưởng nồng độ cơ chất CMC đến kích thước vòng phân giải 74
ương nghiên cứu Trang ixix
Hình 3-20b. Bề mặt đáp ứng hoạt tính enzyme ở nhiệt đô 32,5
0
C với pH và thời
gian ở dạng mặt phẳng 90
Hình 3-21. C-DC cellulase của Micromonospora VTCC-A-1787 91
Hình 3-22. Vòng phân giải cơ chất CMC của C-DC cellulase của chủng
Micromonospora VTCC-A-1787 theo quy trình tối ưu 91
Hình 3-23. Kết quả đường kính thủy phân trước và sau khi kết tủa 92
Hình 3-24. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hoạt độ enzyme 93
Hình 3-25. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ enzyme 94
Hình 3-26. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme 95 ương nghiên cứu Trang xx
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Dưới góc độ y học, rong biển là nguồn thực phẩm tự nhiên quý giá giàu
chất dinh dưỡng, có tác dụng đến sức khỏe và sự ổn định của cơ thể con người.
Hiện nay, nhu cầu sử dụng rong biển làm thực phẩm trên thế giới ngày càng tăng
và phổ biến. Tuy nhiên vấn đề khai thác và chế biến rong biển ở Việt Nam còn
nhiều mới mẻ và hạn chế, không sử dụng hết sản lượng cũng như hiệu quả lợi ích
mà rong đem lại. Hơn nữa, các sản phẩm từ rong biển ở nước ta chưa nhiều, chưa
thực sự được chú ý và phổ biến, rất ít người dân biết đến loại thực phẩm đặc biệt
này, đây đang là một vấn đề còn đang bỏ ngỏ [21].
Ngoài các thành phần dinh dưỡng cơ bản và hàm lượng acid amin quan
trọng vốn có, rong biển còn chứa lượng cel lớn mà cơ thể con người không có
khả năng tiêu hóa
. Cel là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế
bào
thực vật, là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy cel
bằng các tác nhân lý hóa (acid, bazơ mạnh) gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hưởng
đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp và không được khuyến khích
trong chế biến thực phẩm ngày nay. Chính vì vậy mà yêu cầu đặt ra là phải thay
thế bằng các phương pháp an toàn hơn.
Để giải quyết vấn đề này, chúng tôi nhận thấy có thể ứng dụng các chế
phẩm vi sinh vật có hoạt tính cellulase tác động một cách đặc hiệu lên cơ chất
cel, đây là loại enzyme hiện nay đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm.
Cellulase là một phức hợp enzyme bao gồm 3 loại enzyme thủy phân cel. Các
enzyme này kết hợp với nhau và tham gia phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4
glucoside từ bên trong phân tử cel và một số loại polysaccharide tương tự khác
tạo thành glucose và một số đường chức năng như Oligossacharide. Các nghiên
cứu về Oligossacharide trong thực phẩm và dinh dưỡng đang là vấn đề quan tâm
gia tăng giá trị rong biển Việt Nam, đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm
enzyme cellulase kỹ thuật từ xạ khuẩn và ứng dụng sản xuất thử nghiệm bột
rong thực phẩm” là cần thiết.
2. Mục đích nghiên cứu của đề tài
Thăm dò các điều kiện thích hợp để khai thác và thu nhận dịch chiết và
chế phẩm enzyme kỹ thuật từ XK chi Micromonospora. Sau đó sử dụng C-CPE
này thủy phân rong Porphyra Việt Nam để sản xuất bột rong thực phẩm.
ương nghiên cứu Trang 33
3. Nội dung nghiên cứu của đề tài
- Nghiên cứu lựa chọn chủng xạ khuẩn Micromonospora thích hợp và
nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme cellulase có hoạt tính cao.
- Nghiên cứu phương pháp thích hợp để thu nhận dịch chiết và chế phẩm
enzyme kỹ thuật ở quy mô phòng thí nghiệm.
- Bước đầu nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme trên thủy phân rong
mứt sản xuất bột rong thực phẩm và đánh giá chất lượng của bột rong này.
4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của luận văn góp phần thêm những hiểu biết về đặc
tính enzyme cellulase sản xuất từ XK được phân lập tại Việt Nam và ứng dụng
của enzyme này trong chế biến thực phẩm.
- Tạo ra dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho sinh viên và cán bộ kỹ
thuật, bổ sung vào các tài liệu phục vụ cho giảng dạy ngành Công nghệ Thực
phẩm, ngành Công nghệ sinh học.
5. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Bước đầu nghiên cứu sử dụng enzyme chiết rút từ XK Micromonospora
để thủy phân rong biển và thu chế phẩm là bột rong. Kết quả thu được là cơ sở để
Noack phân lập được chúng từ cỏ khô. Năm 1912, Gilbert cũng đã phân lập được
XK ưa nhiệt từ nhiều cơ chất khác nhau như không khí, cát, sa mạc, than bùn,
đặc biệt là trong ruột người và nước cống thải. Tendler (1959) và Burkholder
(1960) đã phân lập được hơn 100 chủng XK ưa nhiệt thuộc 2 giống
Thermomonosprora và Streptomyces từ các mẫu đất khác nhau của các nước Mỹ,
Pháp, Tây Ban Nha, Ý, Pêru, Chilê. Kosmather (1953, 1962) đã phân lập được
nhiều chủng XK ưa nhiệt từ các vùng Liên Xô cũ như miền Bắc, miền Tây, các
vùng núi cao như Capcazơ, Palmia…
Waksman (1959) khi phân lập và tuyển chọn XK ưa nhiệt đã cho thấy
chúng hầu như có mặt trong tất cả các loại đất và ở các mùa trong năm. Ngay ở
vùng ôn đới nhiều loại đất cũng thường có 10.000÷15.000 mầm XK trong 1 gam
đất khô. Vào mùa đông số lượng XK ưa nhiệt chỉ chiếm khoảng 10÷15% so với
tổng vsv ưa nhiệt, nhưng đến mùa hè thì số lượng chúng tăng lên đến 70÷90%.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000÷2.400.000 mầm XK,
chiếm 9÷45% tổng số VSV [45].
Sự phân bố của XK còn phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, độ pH môi trường.
XK được chia làm 2 loại là ưa ấm, phát triển và sinh trưởng ở nhiệt độ từ
25÷45
o
C và ưa nhiệt từ 50÷70
o
C, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và
ương nghiên cứu Trang 55
kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8÷7,5. Ở các vùng đất khô chúng có thể chiếm 25%
tổng số hệ vsv đất. Trong XK, chủng Streptomyces và Micromonospora chiếm tỷ
lệ lớn, đây là chủng có khả năng phân hủy cellulose mạnh và là nhóm vsv amôn
hóa, có khả năng tiết kháng sinh vào môi trường đất.
khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay
dạng màng dẻo, có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành
phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm. Khuẩn lạc XK có màu sắc khác nhau: da cam,
vàng, nâu tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh [6].
- Khuẩn ty: Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2
loại: một loại cắm sâu vào môi trường gọi là khuẩn ty cơ chất với chức năng dinh
dưỡng là chủ yếu, tùy thuộc vào từng loài mà mức độ đâm sâu vào môi trường
thạch khác nhau. Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh với
chức năng chủ yếu là sinh sản. Đường kính khuẩn ty XK thay đổi trong khoảng
0,2÷0,1µm đến 2÷3µm [23].
Các sản
phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố,
enzyme, vitamin, acid hữu cơ có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào XK
hay được tiết ra trong môi trường.
Về cách thức sinh sản
- Sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi: Mỗi đoạn sợi xạ khuẩn khi đứt ra
đều có khả năng nảy chồi tạo ra hệ sợi XK.
- Bằng sự nãy chồi phân nhánh: Trên bề mặt XK xuất hiện những mấu
lồi, những mấu lồi lớn lên thành chồi, chồi lớn lên thành nhánh mới.
- Phân cắt trực tiếp tế bào.
Bào tử XK được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh
gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử ở các loài XK khác nhau thì có kích
thước và hình dạng khác nhau. Đây là cơ quan sinh sản đặc trưng của XK, đặc
điểm hình dạng cuốn sinh bào tử là một trong những tiêu chuẩn quan trọng nhất
phân loại XK. Cuốn sinh bào tử của XK có loài có cấu trúc theo dạng thẳng hoặc
hình lượn sóng (RF), có loài dạng lò xo (S) hay xoắn ốc. Sắp xếp của các cuốn
sinh bào tử cũng khác nhau, có thể sắp xếp theo kiểu mọc đơn, mọc đôi, mọc
ương nghiên cứu Trang 7
ương nghiên cứu Trang 88
1.1.4. Hệ thống và đặc điểm phân loại xạ khuẩn chi Micromonospora
Theo một số tài liệu [31,37,41,45] vị trí phân loại của Micromonospora
được xếp như sau:
Giới (Kingdom) Bacteria
Ngành (Phylum) Actinobacteria
Lớp (Class) Actynomycetes
Bộ (Order) Actinomycetales
Họ (Family) Micromonosporaceae
Chi (Genus) Micromonospora
1.1.4.1. Khả năng phân bố
Mỗi loại VSV có sự phân bố trong tự nhiên là khác nhau, ngay cả khi
chúng cùng một chủng loại. Teplakova và Maximova (1957) đã chỉ tìm thấy
Micromonospora có rất ít trong đất, chỉ chiếm 1,2% Micromonospora trong khi
phân lập Actinomycetes. Szabo’Zsusza (1986) đã nhận thấy tỷ lệ của
Micromonospora trong đất núi là 2,6%, đất trồng trọt là 14%, đất than bùn từ
50÷60%. Đất bùn giàu nguyên liệu hữu cơ rất thích hợp cho sự phát triển của
Micromonospora. Theo Cross và Collins (1966), 1 gam bùn hồ có khoảng 4000
Micromonospora. Nước hồ có rất ít Actinomycetes nhưng có đến 76% là
Micromonospora, trong khi đó Streptomyces chỉ có 6% (Unbreit và McCoy,
1941). Gramein và Meyers (1958) đã tìm thấy Micromonospora từ nước biển và
đất phù sa, những Micromonospora này rất chịu muối, chúng chiếm đa số trong
các phân lập Actinomycetes từ đất phù sa của biển.
1.1.4.2. Đặc điểm hình thái của Micromonospora
- Micromonospora có hệ sợi sinh trưởng mạnh, khuẩn ty cơ chất phân
nhánh, thường không có khuẩn ty khí sinh, có vách ngăn, bắt màu Gram dương
Hầu hết các loài hiếu khí, mẫn cảm với pH dưới 6,0.
- Bào tử của Micromonospora ngược lại với bào tử Streptomyces, chịu
được nhiệt độ và dung môi hữu cơ. Chúng có thể tồn tại trong nước 60
o
C trong
90 phút, nhưng chết ở 90
o
C trong 15 phút. Bào tử chịu được pH từ 6,0÷8,0,
thường bị mẫn cảm ở pH acid mạnh. Bào tử có thể sống sót trong các dung môi
hữu cơ nồng độ không quá 80%, bào tử có sự kháng cao với dioxal, aceton.
1.1.4.4. Ứng dụng trên quần thể Micromonospora
Các Micromonospora có các đặc tính sinh lý, sinh hoá như phân hủy cel,
kitin, lignin, xylan, tinh bột, casein, khử nitrat, protein, đóng vai trò vô cơ hoá
các nguyên liệu hữu cơ và trong sự mùn hoá. Ngoài ra Micromonospora có khả
năng tạo kháng sinh thuộc nhiều nhóm khác nhau về mặt hoá học như:
amynoglycosid, macrolid, ansamycin, polypeptid [44].
ương nghiên cứu Trang 1010
+ Một số kháng sinh nhóm Amynoglycosid: Gentamycin do
M.Echinospora và M.Purpurea (Weinstein & cs, 1963; Luedemann & Brodsky,
1964); Micromonosporin do M.sp ATCC 10026 (Wagman & cs, 1974);
Sisomycin do M.Injoensis (Weinstein & cs, 1970); Neomycin B do M.sp 69-638
(Wagman & cs, 1973); Verdamycin do M.Gramisea (Weinstein & cs, 1975);
Fortimycin A & B do M. Olivasterospora (Naro & cs, 1977; Kawamoto & cs, 1983).
+ Một số kháng sinh nhóm Macrolid: Megalomycin do M.Megalomicea
(Weinstein & cs, 1969); Rosamycin do M.Rosarria (Wagman & cs, 1972); XK-
41 do M.Rnositola (Kawamoto & cs, 1974); Juvenimycin do M.Chalcea &
Izumensis (Hatano & cs, 1976); M-4365 do M.Capillata (Furumai & cs, 1977);
nhiên, được cấu tạo từ các đơn vị β-glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,4
glucoside (Hình 1.2). Các gốc glucose trong cel thường lệch nhau một góc 180
0
và có dạng như một chiếc ghế bành. Mỗi phân tử cel thường chứa 1.400÷15.000
gốc D-glucose (M = 5.10
4
÷ 2,5.10
4
) [30].
Công thức nguyên của cel (giống tinh bột): (C
6
H
10
O
5
)
n
(a) (b)
Hình 1-3. Cấu trúc không gian (a) và cấu trúc phân tử cellulose (b)
* Tính chất và vai trò
Cel trong tự nhiên dưới dạng sợi và không hoàn toàn nguyên chất. Cel là
chất rắn, màu trắng, không mùi vị, trong tế bào thực vật thường liên kết chặt chẽ
với các thành phần khác như hemicellulose, pectin, lignin, các chất nhựa, các
muối vô cơ. Không như các sợi truyền thống có một phạm vi tính chất xác định
như sợi thủy tinh, sợi aramid, sợi carbon, các sợi cellulose tự nhiên có tính chất
thay đổi không xác định thấy rõ.
Bảng 1.1. Hàm lượng cellulose của các loại thực vật
(% trọng lượng khô tuyệt đối)
Kích thước, mm
Loại
Cellulose
(%)
Dài
(trung bình)
Rộng
(trung bình)
Bông 85÷90 25.0 0.020
Hạt lanh 43÷47 30.0 0.020
Chuối 56÷63 6.0 0.024
Tre 26÷43 2.7 0.014
Cỏ giấy 33÷38 1.9 0.013
Cói 38÷44 1.8 0.012
Bã mía 32÷37 1.7 0.020
Rơm ngũ cốc 31÷45 1.5 0.023
Rơm bắp 32÷35 1.5 0.018
Rơm lúa mì 33÷39 1.4 0.015
Rơm lúa gạo 28÷36 1.4 0.008
cho chức phận tổng hợp của chúng. Các thức ăn có chứa hàm lượng lipid cao sẽ
làm cho vi khuẩn kỵ khí trong ruột sinh sôi nảy nở nhiều khiến cho các steroid
trung tính hoặc có tính acid, đặc biệt là acid choleic (các chất chuyển hóa acid
choleic trong phân tăng lên là chất gây ung thư). Chất xơ trong thức ăn sẽ ức chế
hoạt động của các vi khuẩn kỵ khí, thúc đẩy vi khuẩn hiếu khí sinh trưởng, làm
cho lượng hình thành acid choleic trong đại tràng giảm xuống. Cellulose có tác
dụng kích thích nhu động ruột, vì thế dùng để điều hòa bài tiết.
- Phòng ngừa xơ vữa động mạch: Gần đây nhiều nghiên cứu cho thấy cel
tạo điều kiện cản trở sự hấp thụ cholesterol (nhờ tính nhớt) và ức chế sự tổng hợp
cholesterol trong máu (nhờ sự lên men), có vai trò nhất định trong phòng ngừa xơ
vữa động mạch.
- Phòng ngừa hình thành sỏi mật, giảm được hàm lượng mỡ và cholesterol
trong máu (nhờ khả năng kết hợp với acid mật), ngăn ngừa sự thừa dinh dưỡng
và béo phì.
Copyright: Tài liệu đại học ©