BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

BÙI HUY CHÍCH
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN
CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN (Kappaphycus
alvarezii) BẰNG ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
VÀO SẢN XUẤT TRÀ UỐNG HÒA TAN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
Chuyên ngành
Mã số
:
:
Công nghệ sau thu hoạch
60.54.10
Người hướng dẫn khoa học: TS. Đỗ Văn Ninh
Nha Trang - 2009
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả luận văn
ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Luận văn này
Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang,
Ban Chủ nhiệm Khoa Chế biến sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và
nghiên cứu tại trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được dành cho thầy: TS. Đỗ Văn Ninh-
Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động

Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng biểu
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 - TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3
1.1. Giới thiệu về rong sụn [18, 35, 47] 3
1.2. Tổng quan về Car 4
1.2.1. Công nghệ sản xuất Car 4
1.2.1.1. Ở ngoài nước 4
1.2.1.2. Ở trong nước 6
1.2.2. Cấu tạo của Car 7
1.2.3. Tính chất lý hoá của Car 10
1.2.3.1. Tính chất của một polymer 10
1.2.3.2. Nhiệt độ nóng chảy 11
1.2.3.3. Sự tạo gel và keo hoá (gelation) 11
1.2.3.4. Tính bền axit 12
1.2.3.5. Tính tan 12
1.2.3.7. Tính thủy phân và sự metyl hoá xác định công thức cấu tạo của Car 13
1.2.3.8. Độ nhớt 13
1.2.4. Ứng dụng của Car 14
1.2.4.1. Ở nước ngoài 14
1.2.4.2. Ở trong nước 18
1.3. Tổng quan về enzyme amylase [2, 3, 34, 25, 24] 20
1.3.1. α-amylase 20
v
1.3.2. β-amylase (1,4-α-glucan-maltohydrolase) 23
1.3.3. Glucoamylase (α-1,4 glucan-glucohydrolase) 24
1.4. Tổng quan về vai trò của oligosaccharid đối với sức khỏe [8, 60] 25

3.2.1. Xác định độ nhớt đặc trưng của Car nguyên liệu 44
3.2.2. Tính giá trị khối lượng phân tử trung bình của Car nguyên liệu 45
3.3. Kết quả thăm dò loại enzyme amylase thích hợp cho quá trình thủy phân Car
từ rong sụn 46
3.3.1. Kết quả xác định hoạt độ của enzyme amylase theo phương pháp
Heinkel (nội dung phương pháp được trình bày tại phần 2.1 phụ lục 2) 46
3.3.2. Kết quả xác định mức độ thủy phân Car của Fu, Dia, Ce, Te 47
3.4. Kết quả xác định thông số thích hợp cho quá trình thủy phân Car từ rong sụn 49
3.4.1. Kết quả xác định nồng độ enzyme thủy phân Car 49
3.4.2. Kết quả xác định nhiệt độ thủy phân Car 50
3.4.3. Kết quả xác định pH thủy phân Car 53
3.4.4. Kết quả xác định nồng độ Car thủy phân 55
3.4.5. Kết quả xác định thời gian thủy phân 57
3.5. Kết quả xác định khối lượng phân tử trung bình của Dexcar bằng phương
pháp đo độ nhớt 59
3.6. Xác định độ hòa tan của Dexcar 62
3.7. Kết quả xác lập cấu trúc và khảo sát về ATTP của Dexcar 63
3.7.1. Kết quả xác lập cấu trúc của Dexcar [52][53] 63
3.7.1.1 Khảo sát phổ 13C-NMR của Dexcar 63
3.7.1.2. Khảo sát phổ 1H-NMR của Dexcar 66
3.7.2 Khảo sát về an toàn thực phẩm của Dexcar 68
3.7.2.1. Kết quả đánh giá độ sạch của Dexcar 68
3.7.2.2. Hàm lượng kim loại nặng của Dexcar [7] 69
3.7.2.3. Kết quả xác định chỉ tiêu vi sinh vật của Dexcar 69
vii
3.8. Kết quả bước đầu ứng dụng bột Car thủy phân để sản xuất trà uống hòa tan 70
3.9. Đề xuất quy trình sản xuất trà uống hòa tan 78
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 80
TÀI LIỆU THAM KHẢO 82
viii

Hình 3.1. Sự phụ thuộc độ nhớt riêng vào nồng độ của Car 45
Hình 3.2. Hoạt độ của enzyme amylase 47
Hình 3.3. Mức độ thủy phân Car của Fu, Dia, Ce, Te 48
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ Te đến mức độ thủy phân Car 50
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân Car 51
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân Car (40 ppmCa2+) 53
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến mức độ thủy phân Car 54
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ Car đến mức độ thủy phân Car 56
Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến mức độ thủy phân Car 57
Hình 3.10. Sự phụ thuộc độ nhớt riêng vào nồng độ của Dexcar 60
Hình 3.11. Sự phụ thuộc độ nhớt riêng vào nồng độ của Dexcar 61
Hình 3.12. Độ hòa tan của Dexcar 64
Hình 3.13. Phổ 13C-NMR của mẫu chuẩn κ-carrageeanan [7] 65
Hình 3.14. Phổ 13C-NMR của Dexcar 65
Hình 3.15.
κ
-Dexcarrageenan từ rong sụn 66
Hình 3.16. Phổ 1H-NMR của mẫu chuẩn κ-carrageenan 67
Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của Dexcar 67
Hình 3.18. Điểm trung bình thị hiếu của 2 mẫu nước trà hòa tan 77
1
MỞ ĐẦU
Rong sụn là loài rong biển được loài người biết đến từ lâu và Car thu nhận
được từ rong sụn có phổ sử dụng rất rộng rãi trong mọi lĩnh vực sản xuất và đời
sống tại nhiều nước trên thế giới. Riêng đối với nước ta, rong sụn cũng như Car còn
là đối tượng mới, chưa được nghiên cứu và sử dụng nhiều. Mấy năm gần đây, một
số nhà khoa học tại một số cơ quan nghiên cứu và đào tạo đã quan tâm nghiên cứu
chế biến rong sụn và ứng dụng Car vào sản xuất sản phẩm mới. Tuy nhiên, các
nghiên cứu ứng dụng Car còn chưa đáp ứng được yêu cầu đòi hỏi của thực tiễn,
rong nguyên liệu vẫn chủ yếu được xuất khẩu qua thương lái dưới dạng nguyên liệu

từ rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty, thu Dexcar dạng bột và ứng dụng
vào sản xuất trà hòa tan.
Nội dung nghiên cứu
1. Thăm dò loại enzyme amylase thích hợp cho quá trình thủy phân Car từ
rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty.
2. Nghiên cứu tìm thông số thích hợp cho quá trình thủy phân Car từ rong
sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty.
3. Bước đầu ứng dụng bột Car thủy phân để sản xuất trà uống hòa tan.
3
Chương 1 - TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu về rong sụn [18, 35, 47]
Rong sụn thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta), Ngành phụ Rhodophytina,
Lớp: Florideophyceae, Lớp phụ: Rhodymeniophycidae, Bộ: Gigartinales, Họ:
Areschougiaceae, Giống: Kappaphycus, Loài: bao gồm các loài alvarezii, cottonii,
inermis, interme, procrusteanum, striatum. Trong đó loài Kappaphycus alvarezii
(Doty) Doty là loài có sản lượng cao nhất.
Hình 1.1. Hình ảnh Rong sụn Kappaphycus alvarerii (Doty) Doty
Từ tháng 3/1993, chương trình hợp tác về khu hệ và nguồn lợi rong biển kinh
tế Việt Nam giữa Phân viện Vật liệu Nha Trang (nay là Viện nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang) và Nhật Bản, Phân viện Vật liệu Nha Trang đã tiến
hành du nhập rong sụn giống, nghiên cứu nhân giống và thử nghiệm nuôi trồng
rong sụn tại vùng biển Nam Trung bộ nước ta. Với nguồn giống ban đầu này, từ
cuối năm 1993, các nhà khoa học thuộc Phân viện Vật liệu Nha Trang do Ông
Huỳnh Quang Năng phụ trách đã trồng thử nghiệm rong sụn tại các vùng ven biển
của tỉnh Khánh Hòa và Ninh Thuận. Qua thử nghiệm cho thấy, rong sụn hoàn toàn
thích nghi với điều kiện tự nhiên ở nước ta.
Ngoài ra, một số nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu Hải sản Hải Phòng do
PGS.TS. Nguyễn Xuân Lý chủ trì cũng đã tiến hành nghiên cứu trồng thử nghiệm
4
rong sụn ở vùng biển phía Bắc (chủ yếu là vùng biển Hải Phòng). Kết quả thử

Phương pháp thứ nhất chỉ áp dụng từ cuối năm 1970 đến đầu năm 1980, Car
được tách ra từ rong đỏ bằng nước nóng, bã rong được lọc tách ra và dịch chiết
chứa Car được đem sấy khô trực tiếp trên thiết bị sấy kiểu “rulô” để thu được Car ở
dạng màng mỏng sau đó nghiền thành bột. Một số cơ sở sản xuất có tiến hành tinh
chế dịch chiết trước khi làm khô, nhưng thực tế sản phẩm không qua tinh chế thì tạp
chất nhiều, chất lượng thấp, nếu qua công đoạn tinh chế thì phức tạp và giá thành
cao. Sản phẩm Car tinh chế này có thể sử dụng làm chất tạo đông, chất kết dính,…
trong thực phẩm, làm chất nhũ hóa, giữ ẩm, giữ mùi trong công nghệ sản xuất mỹ
phẩm, nước hoa và nhiều lĩnh vực khác như công nghiệp dệt, sơn, thuốc đánh răng,
y dược…
Phương pháp thứ hai, Car không thực sự tách ra khỏi rong. Đúng hơn nguyên
lý này là rửa sạch rong bằng dung dịch kiềm, tách phần Car và phần không tan
khác. Rong được rửa sạch sau đó xử lý bằng dung dịch kiềm KOH ở nhiệt độ thích
hợp cho từng loại rong cụ thể, dung dịch KOH loại bỏ các tạp chất như sắc tố,
protein, muối khoáng, các sợi rong đã xử lý chứa một lượng lớn Car và cellulose,
sau đó sấy khô và nghiền thành bột Car bán tinh chế (SRS). Quy trình sản xuất này
đơn giản và giá thành của sản phẩm rẻ hơn nhiều so với quy trình sản xuất Car tinh
chế, vì không cần dùng alcohol để kết tủa Car, không cần thiết bị chưng cất thu hồi
alcohol, thiết bị tạo gel, tủ đông, máy ép để tách nước thu hồi Car. Sản phẩm bán
tinh chế thường được dùng làm chất kết dính, tạo gel trong công nghiệp sản xuất thức
ăn cho vật nuôi, gia cầm,…. [36, 41, 45, 46].
Sự khác nhau cơ bản giữa Car tinh chế và bán tinh chế đó là Car bán tinh chế
có chứa cellulose, trong khi Car tinh chế thì cellulose đã được tách hoàn toàn trong
quá trình sản xuất. Khi hoà tan Car bán tinh chế vào nước thì sẽ làm dung dịch có
vẩn đục. Tuy nhiên, đối với những sản phẩm mà độ trong không quan trọng hoặc có
6
pha nhiều thành phần như thịt, tinh bột, trứng, phẩm màu thì sử dụng Car bán tinh
chế là phù hợp, giá thành rẻ hơn, do đó được ứng dụng nhiều trong thực phẩm.
Công nghệ sản xuất Car không chỉ phát triển mạnh ở các nước Mỹ và Tây Âu
mà còn đang phát triển mạnh ở các quốc gia Châu Á, trong đó phát triển nhất là

(Kappaphycus alvarezii) ở biển Ninh Thuận. Kết quả nghiên cứu cho biết, tác giả đã
xác định được các hàm lượng và thành phần hoá học như: protein 2,4%; cellulose
4,0%; tro toàn phần 20%; hàm lượng nước 26,6%; Car 40%; hàm lượng SO42- là
23ppm. Qua đó cho ta biết được hàm lượng Car có trong rong sụn là rất cao.[6]
Các nhà khoa học thuộc Trường Đại học Khoa học tự nhiên-Đại học Quốc
gia Hà Nội trong đó có Trần Đình Toại, Vũ Ngọc Ban, Trần Thị Hồng cũng đã có
những báo cáo kết nghiên cứu tách chiết Car từ Rong Hồng vân Eucheuma
gelatinae [7] [10][23].
Năm 2005, Nguyễn Văn Ninh đã nghiên cứu tinh sạch Car thu nhận từ rong
sụn Kappaphycus alvarezii. Kết quả nghiên cứu đã xác định phổ carbon trong chế
phẩm Car sau khi thu qua cột trao đổi ion DEAE sephadex và tính số lượng carbon
trong mẫu Car là 12 nguyên tử carbon tương ứng độ dịch chuyển hóa học của các
nguyên tử carbon trong chế phẩm Car. Phân tích phổ proton và phân tích độ dịch
chuyển hóa học 3-6 anhydro galactose và D-galactose trong chế phẩm Car là
4,38/3,28. [20]
Nói chung, rong sụn là đối tượng mới được du nhập về Việt Nam nên công
nghệ sản xuất Car từ rong sụn cũng được các nhà nghiên cứu trong nước tiếp thu,
áp dụng quy trình đã có của nước ngoài sao cho phù hợp với các đặc điểm của loài
rong sụn được trồng ở nước ta là Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty.
1.2.2. Cấu tạo của Car
Car có cấu trúc chung là một polymer mạch thẳng với liên kết luân phiên của
β-D-galactose pyranose qua liên kết 1,3 và α-D-galactose pyranose qua liên kết 1-4.
8
Các liên kết ở vị trí số 3 xuất hiện ở các gốc có 2 và 4 sulphate hoặc không có
sulphate trong khi liên kết ở vị trí số 4 ở các gốc có 2 sulphate, gốc 2,6 disulphate,
gốc 2,6 anhydro và 3,6 anhydro-2-sulphate. Hợp phần cấu tạo của Car gồm có D-
galactose (17÷31%) còn L-galactose chiếm lượng rất nhỏ. Do đó Car tạo thành chủ
yếu bởi các mạch poly D-galactose bị sulphate hoá có phân tử lượng 500-700 đvC
[16].
Hình 1.2. Cấu trúc của Car với luân phiên liên kết

galactose lại ở vị trí carbon số 2. Iota là Car có nhóm sulphate nhiều nhất trong
mạch phân tử, cấu trúc là vòng xoắn kép bậc II. Gel iota có tính đàn hồi.
 Lambda-carrageenan: trong mạch phân tử gồm các đơn vị: D-galactose-
2-sulphate (1,3) và D-galactose-2,6-disulphate nối xen kẽ với nhau.
10
Các phân đoạn này đều có tính đa phân tán, nhưng chúng chỉ khác nhau về
thành phần sulphate ester và gốc quay quang. Lambda-carrageenan có khối lượng
phân tử cao và mạch dài hơn kappa-carrageenan. Thành phần của phân đoạn này
cũng phụ thuộc vào nhiệt độ tách chiết và loại rong nguyên liệu. [16, 46, 39]
1.2.3. Tính chất lý hoá của Car
1.2.3.1. Tính chất của một polymer
* Khử trong môi trường kiềm
Trong môi trường kiềm có tác dụng khá mạnh đến cấu tạo hoá học của Car.
Dưới tác dụng của môi trường kiềm, nhóm (HOSO3-) bị khử dần tùy thuộc vào mức
độ khử (HOSO3-) sẽ tạo nên cấu trúc khác nhau và tạo nên các loại Car khác nhau.
[16, 46, 39, 59]
+ Mu-carrageenan được khử trong môi trường kiềm tạo ra kappa-
carrageenan.
Mu
Kappa
+ Nu-carrageenan được khử trong môi trường kiềm tạo ra iota-carrageenan.
Nu Iota
+ Trong môi trường kiềm lambda-carrageenan biến đổi thành theta-carrageenan.
11
lambda
theta
* Phản ứng tạo tủa
Car là một polymer mang điện âm nên tủa trong các đại phân tử mang điện
tích dương như: metylen xanh, safranine, mauvine, những phẩm mầu azo và thiazo
khác, tính chất này giống như một vài alkaloid và protein. Ngoài ra, Car còn tủa

Lamda-carrageenan
Nước nóng
Tan ở nhiệt độ trên 70
o
C
Tan ở nhiệt độ trên 70
o
C
Tan
Nước lạnh
Tan trong dung dịch
+
muối Na . Không tan
trong dung dịch muối K
+ 2+
, Ca
Tan trong dung dịch
+
muối Na .
Tan
13
1.2.3.6. Tính hấp thụ hồng ngoại và màu
Dung dịch Car là một chất hữu cơ, nên có khả năng hấp thụ hồng ngoại cho
phổ có bước sóng trong phạm vi nhất định phụ thuộc vào loại và thành phần Car.
Dựa vào tính chất này người ta có thể biết được Car thuộc loại lamda-, iota-,
kappa,… Các loại polysaccharide thường cho bước sóng ở vùng hồng ngoại trong
khoảng 1000-1100cm-1. Với các loại Car tạo gel thì cho đỉnh hấp thụ cực đại (đỉnh
hấp thụ trong khoảng rộng) ở 1065cm-1, loại không tạo gel ở vùng 1020cm-1.
1.2.3.7. Tính thủy phân và sự metyl hoá xác định công thức cấu tạo của Car
Dung dịch Car ít bị thủy phân ở môi trường pH 9 và môi trường pH 7, dung

1.2.4.1. Ở nước ngoài
Do có các tính chất vật lý và hóa học đặc biệt, Car được ứng dụng nhiều
trong lĩnh vực thực phẩm và phi thực phẩm. Trong công nghệ thực phẩm, Car đã
được sử dụng với vai trò là chất phụ gia có tính ưu việt để điều chỉnh độ đặc, tạo
gel, ổn định, phân tán, …Trong việc chế biến ra các loại thực phẩm hấp dẫn, giá trị.
Ngoài ra nó còn được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp, kỹ nghệ như: kỹ
nghệ sơn, công nghiệp dệt, …
Ngày nay, với tốc độ phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật, con người đã
khám phá ra những lợi ích tuyệt vời do Car mang lại trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt
là trong thực phẩm và y học thể hiện trong bảng 1.3 [6, 16, 46, 48, 39].
15
Bảng 1.3. Một số ứng dụng của Car [45]
Sử dụng
Chức năng
Loại Car
Tỷ lệ %
Bánh tráng miệng
Làm đông
Kappa- + iota-
Kappa- + iota- + gôm hạt
bồ kết
0,5-1,0
Kẹo dẻo calo thấp
Làm đông
Kappa- + Iota-
Kappa- + galactomanan
0,5-1,0
Thực phẩm đồ hộp
Ổn định chất béo, làm đặc,
tạo huyền phù gelatin