ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
Vũ Thanh Trà
NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN
CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ
NĂNG
KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 70 01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
:
1. PGS.TS.
Chu Hoàng
Mậu
2. TS.
Trần Thị Phương
Liên
Thái Nguyên - 2012
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Trần Thị Phương Liên. Các
số liệu trình bày trong luận án là trung thực. Một số kết quả đã được công bố
riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công
trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong
luận án này.
Thái Nguyên, ngày
tháng năm 2012
Tác giả luận án
Vũ Thanh Trà

1.1. Cây đậu tương và và đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương
1.1.1. Cây đậu tương
1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương
1.2. Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương
1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 9
1.2.2. Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương
1.3. Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền ở cây đậu tương
1.3.1. Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái
1.3.2. Phương pháp sử dụng chỉ thị hoá sinh học
1.3.3. Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA
1.4. Các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương
1.5. Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. Vật liệu 33
2.1.1. Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh
2.1.2. Hóa chất
2.1.3. Máy mọc và thiết bị
2.1.4. Mồi của phản ứng RAPD và SSR
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo
4459
1111
2
223333
44
iv
2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa sinh
2.2.3. Các phương pháp phân tích đa hình di truyền DNA
2.2.4. Các phương pháp phân tích đa hình protein
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

79
v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
µl
2DE
AFLP
APS
AUDPC
Microliter
Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều
Amplified fragment length polymorphism - Đa dạng chiều dài các
phân đoạn được nhân bản
Ammonium persulfate
Area Under Disease Progress Curve
Avr protein Avirulence protein – Protein không nhiễm bệnh từ mầm bệnh
AVRDC
Bp
CHAPS
Cm
CTAB
DNA
dNTPs
DTT
EDTA
ESI-Q
TRAP
EtBr
HPLC
IAA
IEF

mA
MAS
ml
MS/MS
NST
OD
PCR
PEG
PIC
PMSF
PR protein
QTL
R gen
R protein
RAPD
RFLP
RNA
SAR
SDS
SDS-
PAGE
SSR
TAE
TCA
TEMED
UPGMA
V
w/v
Kilo Dalton
MiliAmpe

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Danh sách các giống đậu tương nghiên cứu
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 20 mồi RAPD
Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi SSR
Bảng 2.4. Thành phần gel và sơ đồ nhuộm bạc theo phương pháp cải tiến
Bảng 2.5. Thành phần gel polyacrylamide
Bảng 3.1. Phản ứng của các giống đậu tương đối với bệnh gỉ sắt
Bảng 3.2. Hàm lượng protein và lipit trong hạt của 50 giống đậu tương
Bảng 3.3. Thành phần của các amino acid của 20 giống đậu tương
Bảng 3.4. Tỷ lệ phân đoạn đa hình và giá trị PIC của các mẫu nghiên cứu
Bảng 3.5. Kết quả phân tích sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR
Bảng 3.6. Danh sách các protein của lá đậu tương giống DT2000 được
nhận diện bằng phương pháp khối phổ
Bảng 3.7. Đa dạng mức độ biểu hiện của các protein giữa mẫu thí nghiệm
và đối chứng của hai giống nhiễm bệnh (DT12 và VMK)
Bảng 3.8. Nhận diện các protein có mức độ biểu hiện khác nhau giữa thí
nghiệm và đối chứng ở hai giống nhiễm bệnh DT12 và VMK
Bảng 3.9. Mức độ protein biểu hiện khác nhau giữa giống nhiễm bệnh
gỉ sắt mẫn cảm với bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) và giống
kháng (DT2000, CBU8325)
Bảng 3.10. Nhận diện các protein có mức độ thay đổi giữa giống nhiễm
với và giống kháng bệnh gỉ sắt
3
334455
6
6
7
8
9

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M18
Sơ đồ hình cây của 50 giống đậu tương dựa trên hệ số tương
đồng di truyền xác định bằng chỉ thị RAPD và kiểu phân
nhóm UPGMA
Các alen tại locus Satt009 (A), Satt175 (B), Satt146 (C) Satt
005 (D) của 50 giống đậu tương
Sơ đồ hình cây về mối quan hệ của 50 giống đậu tương có phản
ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ thị phân tử SSR
Hình ảnh điện di SDS-PAGE 12,5% của protein chiết từ lá
đậu tương VMK, CBU8325 đối chứng và nhiễm bệnh ở hai
giống đậu tương DT12 và VMK 9 ngày tuổi
1111445666777
ix
Hình 3.8.
Hình 3.9.
Hình ảnh điện di 2-DE so sánh mức độ biểu hiện protein lá đậu
tương giống DT2000 ở thời điểm 6 (A) ngày và 9 ngày (B)
So sánh sự đa dạng về protein lá đậu tương của các giống
DT12, DT2000, CBU8325 và VMK
Hình 3.10. Kết quả phân tích và nhận diện protein catalase bằng sắc ký -
khối phổ
Hình 3.11. Phân nhóm chức năng hệ protein lá đậu tương giống DT2000
Hình 3.12. So sánh đa dạng protein lá đậu tượng đối chứng và thí nghiệm
của 2 giống sau khi gây nhiễm bệnh 9 ngày (DT12 và VMK)
Hình 3.13. So sánh sự đa dạng protein lá đậu tương sau gây nhiễm 9
ngày của hai giống nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) và 2
giống kháng bệnh gỉ sắt (DT2000 và CBU8325)
7
8
8

thiệt hại đáng kể, làm giảm từ 10-80% năng suất và chất lượng đậu tương ở
2
nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam. Yêu cầu đặt ra hiện nay là cần
phải chuyển giao các tiến bộ khoa học kỹ thuật đặc biệt là tạo ra những giống
cây có năng suất cao, có khả năng chống chịu bệnh để đưa vào sản xuất mở
rộng diện tích gieo trồng và nâng cao chất lượng hạt, đáp ứng được nhu cầu
đậu tương trong nước cũng như phục vụ xuất khẩu. Do đó, nghiên cứu chọn
tạo các giống đậu tương mới có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cao là một giải
pháp mang tính chiến lược cho sự phát triển bền vững.
Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã
được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể, tuy nhiên hầu hết các
nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc giám sát quá trình phát triển bệnh,
nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá sự thất thu năng suất hoặc phân tích phản ứng
bệnh mà chưa chú trọng nhiều đến việc tìm hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt
cũng như đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương có khả năng
kháng bệnh gỉ sắt cũng như cơ chế phân tử của hiện tượng này. Việc nghiên
cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối
với bệnh gỉ sắt không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng
kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có
chất lượng cao.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng
kháng bệnh gỉ sắt khác nhau”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Đánh giá được khả năng phản ứng của các giống đậu tương với bệnh gỉ
sắt nhằm phát hiện các giống kháng và nhiễm mới.
2.2. Xác định được sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA của các giống đậu
tương nghiên cứu.
3
2.3. So sánh đa hình protein, lập được bản đồ điện di protein lá đậu tương, sơ

Tỷ lệ đậu quả 20 - 30% tuỳ từng vụ Quả thuộc loại quả giáp, khó tách, hơi
cong, lúc quả non có màu xanh, nhiều lông (có khả năng quang hợp do có
diệp lục) khi chín có màu nâu. Tuỳ điều kiện canh tác mỗi cây con cho từ 20 -
400 quả. Hạt có nhiều hình dạng: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt có giá trị
dinh dưỡng cao. Hạt to, nhỏ tuỳ theo các giống khác nhau, khối lượng 1000
hạt thay đổi trung bình từ 100 - 200g. Màu sắc rốn hạt ở các giống khác nhau
là một biểu hiện đặc trưng của giống [9].
Về đặc điểm di truyền, đậu tương Glycine max có bộ nhiễm sắc thể
(NST) lưỡng bội 2n = 40 là cây tự thụ phấn, ít có khả năng thụ phấn chéo.
5
Những nghiên cứu về hệ gen (genome) đậu tương cho thấy, bộ gen đậu tương
có từ 1,29 x 10
9
đến 1,8 x 10
9
bp cho bộ đơn bội. Trong số đó có khoảng 40 -
65% trình tự lặp lại (những trình tự này có kích thước nhỏ hơn 0,3 - 0,4kb),
các trình tự không lặp lại chiếm khoảng 35 - 60% (có chiều dài 1,1 - 1,4kb)
được xếp xen kẽ với trình tự lặp lại [95].
Thời gian sinh trưởng của đậu tương được chia làm 3 loại: chín sớm
(từ 75 - 78 ngày); chín trung bình (từ 80 - 100 ngày) và chín muộn (từ 110
- 120 ngày). Thời gian sinh trưởng là yếu tố rất quan trọng để lựa chọn cây
trồng luân canh hay xen vụ. Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều
kiện ngoại cảnh và các mầm bệnh, các giống thường thích hợp với từng vụ
khác nhau [3]
.
1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương
1.1.2.1. Thành phần protein trong hạt đậu tương
Trong hạt đậu tương, hàm lượng protein chiếm từ 12-55%. Thực tế cho
thấy, tuy kiểu gen và điều kiện canh tác làm ảnh hưởng tới hàm lượng protein

point-pI). Tỷ lệ giữa glyxinin và β-conglyxinin là 1,6: 1,0 (biến thiên từ tỉ lệ
3,0: 1,0 đến 1,0: 1,0 tuỳ giống). Glyxinin là nguồn dự trữ carbon và nitơ và
được tích trữ trong quá trình hình thành phôi.
Protein của cây họ đậu nói chung và cây đậu tương nói riêng được coi
là có chất lượng tốt nhất trong các loại protein của thực vật, bởi vì chúng chứa
tất cả các amino acid không thay thế và cần thiết cho cơ thể. Hơn nữa protein
của cây họ đậu còn có hàm lượng lysine rất cao so với protein từ các loại ngũ
cốc khác. Tuy vậy, hàm lượng các amino acid chứa gốc SH như methionine,
cysteine vẫn còn thấp [3].
7
1.1.2.2. Lipid, vitamin và một số chất khác trong hạt đậu tương
Lipid là hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không có khả năng hoà
tan trong nước, nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như
ete, benzen, toluen, ete, dầu hoả Lipid còn là thành phần quan trọng của
màng sinh học, là nguồn năng lượng cung cấp cho cơ thể. Ở đậu tương, hàm
lượng lipid chiếm từ 12-25% khối lượng khô. Chất lượng lipid của hạt đậu
tương rất tốt, cho nên nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến
thực phẩm. Hạt đậu tương còn có các loại vitamin tan trong lipid, đặc biệt là
vitamin E (200 mg/100g lipid). Ngoài ra, trong hạt đậu tương còn chứa một
số chất khác như carbohydrade, muối khoáng, nucleic acid, kích thích sinh
trưởng [3]. Nói chung, hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng rất cao. Giá trị của
nó được đánh giá đồng thời cả về hàm lượng protein và lipid, trong đó hàm
lượng protein dự trữ và chất lượng của chúng là yếu tố quyết định, làm cho
hạt đậu tương trở thành nguồn thực phẩm quan trọng cho người và làm thức
ăn cho gia súc. Hạt đậu tương có thể chế biến ra 600 sản phẩm khác nhau.
Bên cạnh đó, đậu tương còn được dùng làm thuốc chữa bệnh rất tốt, nhất là
hạt đậu tương có màu đen.
1.1.2.3. Protein lá và hệ protein lá đậu tương
Protein là các đại phân tử có ở lượng lớn trong tất cả các loại tế bào và
các bào quan. Protein lá đậu tương rất đa dạng, có hàng nghìn loại với kích

Gần đây, các nghiên cứu về hệ protein thực vật sử dụng phương pháp
điện di 2 chiều (Two dimension electrophoresis-2DE) đã được công bố [33],
[58], [74], [86], [92]. Một số nghiên cứu tập trung vào hệ protein của các bào
quan như lục lạp [47], [72], ty thể [33], một số lại tập trung vào các mô thực
vật như lá ngô [92], lá đào [101]. Các nghiên cứu trên rễ đậu tương [116]
9
hoặc trên hạt đậu tương đã thu được một số kết quả đáng kể [58], [83], [86],
tuy nghiên các nghiên cứu về protein ở lá đậu tương vẫn đang ở mức sơ khai.
Trong nghiên cứu của Sarma và cộng sự, các tác giả đã thành công trong việc
phân tách hàng trăm các protein của các mô như lá, hạt và rễ đậu tương khi sử
dụng phương pháp tách chiết protein và điện di 2 chiều [100]. Trong khi đó,
Krishnan và cộng sự đã nghiên cứu hệ protein lá đậu tương bằng phương pháp
điện di 2 chiều và khối phổ, các tác giả đã phát hiện được 28 loại
phosphoprotein trong lá [68]. Tương tự trong nghiên cứu của Xu và cộng sự,
bằng phương pháp điện di và khối phổ các tác giả đã phân tách được 119
điểm protein trong đó đã nhận diện được 71 protein ở lá đậu tương [113]. Đây
là hướng nghiên cứu đầy hứa hẹn, bằng việc áp dụng các kỹ thuật proteomics
(kỹ thuật nghiên cứu, phân lập, tách chiết, phân tách và nhận diện cấu trúc,
chức năng của hệ protein) các tác giả đã gợi ý các ứng dụng trong việc xác
định các protein kháng bệnh.
Cho đến nay, các nghiên cứu về protein lá đậu tương còn rất hạn chế.
Đặc biệt trong vấn đề phân tích, nhận dạng và lập bản đồ hệ protein lá đậu
tương còn ít được công bố [113]. Từ thực tiễn đó, trong khuôn khổ luận án
này chúng tôi mong muốn nghiên cứu tìm hiểu và lập bản đồ hệ protein của lá
đậu tương, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
1.2. Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương
1.2.1. Bệnh gỉ sắt
ở cây đậu tương
Bệnh gỉ sắt do nấm
Phakopsora pachyrhizi

11
Dấu hiệu và triệu chứng bệnh: Nấm gỉ sắt phát triển trên tế bào và có
mặt ở hầu hết các vụ cây trồng, nhưng bệnh chỉ phát sinh và phá hại nặng
nhất trong vụ đậu tương xuân. Bệnh gây hại nặng nhất ở lá, nhưng cũng có
thể ở trên thân, cành và quả. Biểu hiện sớm nhất của bệnh là những chấm màu
trong ở phiến lá, cỡ 1mm, sau lớn dần và chuyển màu vàng rồi nâu, đạt tới
kích thước từ 2-5mm với hình đa dạng, có góc cạnh (Hình 1.1A). Các vết
bệnh có thể phát triển rộng và liên kết với nhau thành từng mảng, làm cho
phiến lá bị rách nát. Ở mặt dưới phiến lá, nơi có vết bệnh, xuất hiện lớp bột
màu nâu đó là các bào tử hạ của nấm. Khi bị nấm tấn công, trong mỗi đốm lá
bị tổn thương có nhiều vết nứt, hoặc các ổ bào tử hạ (uredinia) màu nâu đỏ
bên trong chứa các bào tử hạ (urediniospore) hình oval, màu sẫm, bề mặt có
nhiều gai nhỏ (hình 1.1B và 1.2). Các thể bào tử sẽ được giải phóng từ các lỗ
nhỏ hoặc vết nứt trên mặt lá. Bệnh gỉ sắt phát sinh ở các lá già gần mặt đất, sau
lan lên các bộ phận khác ở phía trên của cây. Tác hại của bệnh gỉ sắt là làm cho
lá cây đậu tương giảm hoặc mất khả năng quang hợp, gây rụng lá hàng loạt dẫn
đến giảm năng suất quả, tỷ lệ hạt lép cao. Từ khi cây đậu tương có 5-6 lá và
nhất là khi bắt đầu ra hoa, bệnh xâm nhiễm mạnh nhất và sau đó phát triển kéo
dài tới khi thu hoạch. Nấm xâm nhiễm cả vào quả làm cho hạt không thể phát
triển bình thường. Do đó, năng suất và phẩm chất hạt đậu tương bị giảm sút
nghiêm trọng. Những ruộng bị bệnh nặng hầu như không cho thu hoạch. Bệnh
gỉ sắt thường tập trung cao điểm vào tháng 3 và tháng 4 khi nhiệt độ đạt từ 20 -
28
0
C và cây đậu có từ 3 lá kép đến khi thu hoạch quả. Đặc điểm này liên quan
tới sự tích luỹ và biến động hàm lượng protein và amino acid trong các giai
đoạn sinh trưởng ở các tuổi cây khác nhau [6].
12
Hình 1.2. Hình ảnh nấm gây bệnh gỉ sắt ở đậu tương P. pachyrhizi chụp dưới
kính hiển vi điện tử [118]

Cho đến nay, có nhiều nhóm protein PR với các chức năng khác nhau đã được
phát hiện [73]. Các protein này thường xuất hiện trong mô tế bào sau khi lây
nhiễm bệnh từ vài phút đến vài giờ, chúng đều là các chất kháng khuẩn,
kháng nấm và tham gia vào bảo vệ tế bào thực vật khỏi các tác động của mầm
bệnh [10], [44]. Khi có sự tương tác giữa nấm và tế bào thực vật, các protein
Avr (avirulence protein) được hình thành từ sợi nấm và từ giác mút sẽ được
chuyển vào nguyên sinh chất của tế bào thực vật bằng các con đường khác
nhau [44],[64], [73]. Protein Avr có nhiều loại và là các protein nhỏ có trong
giác mút của sợi nấm được tiết vào tế bào thực vật cùng với các protein khác
qua các màng giác mút. Protein R trong nguyên sinh chất của cây chủ nhận
biết protein Avr và hoạt hóa hệ thống tín hiệu bảo vệ của tế bào thực vật [39].
Ở cây lanh (Linum usitatissimum) kháng nấm gây bệnh gỉ sắt, protein
AvrL567 của nấm gây bệnh được nhận biết bằng các protein kháng của cây
14
chủ như protein L4, protein L6 và protein L7, hoặc các protein AvrM, AvrP4
của nấm được nhận biết bằng các protein M và P4 của cây chủ [46]. Ngoài ra,
từ sợi nấm, protein Avr cũng có thể xâm nhập vào nguyên sinh chất và tương
tác với protein R theo các cách khác nhau như hình 1.3.
Hình 1.3. Mô hình hoạt động của protein kháng bệnh ở nấm
Tại Trung tâm phát triển Rau màu Châu Á (AVRDC), việc xác định
tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu
tương
là một mục tiêu quan trọng với
hơn 9000 dòng đậu tương đã được sàng lọc. Cả tính kháng làm giảm tốc độ
phát triển, tính kháng chuyên biệt và tính chống chịu đều xuất hiện trên chất
mầm (germ plasm)
của
cây đậu tương
[79].
Đặc tính kháng bệnh gỉ sắt của đậu tương là không ổn định và khá phức