DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis 5
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 14
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 15
Bảng 3.3: Thành phần môi trường MPA dạng thạch 16
Bảng 3.4: Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease [19],[30]
16
Bảng 3.5: Môi trường thử hoạt tính của enzyme protease [24] 16
Bảng 3.6: Môi trường lên men đường maltose 16
Bảng 3.7: Môi trường Simmons Citrate Agar 17
Bảng 3.8: Môi trường khử nitrate 17
Bảng 3.9: Môi trường lòng đỏ trứng 17
Bảng 3.10: Môi trường Clark Lubs 18
Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis từ các mẫu
đất 28
Bảng 4.2: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập
33
Bảng 4.3 : Kết quả đo bán kính vòng phân giải casein của 10 chủng vi
khuẩn phân lập (mm) 36
Bảng 4.4 : Kết quả đo tốc độ sinh trưởng và hoạt độ protease của 3 chủng
37
Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh
trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn KTC1 38
Bảng 4.6: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh
trưởng và sinh tổng hợp protease của vi khuẩn KTC1 40
Bảng 4.7: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh
tổng hợp enzyme protease của KTC1 41
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis 3
Hình 4.1 : Đồ thị đường chuẩn Tyrosine 26
Hình 4. 1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn phân lập được 32
2.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật 8
2.2.4. Tính ưu việt và các ứng dụng của protease vi sinh vật 9
2.2.5. những nghiên cứu phân lập, tuyển chon, thu nhận enzyme protease từ Bacillus
nói chung và Bacillus subtilis nói riêng 12
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.1. Đối tượng khảo sát 14
3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 14
3.2.1. Thời gian : 23/12/2013 – 31/5/2014 14
3.2.2. Địa điểm 14
3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng 14
3.3.1. Hóa chất 14
3.3.2. Thiết bị và dụng cụ 14
3.3.3 Môi trường sử dụng 15
3.4. Nội dung nghiên cứu 18
3.5. Phương pháp thực hiện đề tài 18
3.5.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 18
3.5.2. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính protease cao 23
3.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh trưởng và
tạo enzyme của các chủng vi khuẩn 26
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ các mẫu đất 28
4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis từ các mẫu đất 28
4.1.2 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus
subtilis 32
4.2. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp protease
35
4.2.1 Kết quả khảo sát vòng phân giải của 10 chủng phân lập được 35
4.2.2. Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của 3 chủng KTB2,
nhau như động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên thu enzyme từ cơ thể động vật
hay thực vật thì rất khó khăn và tốn kém vì thường phải phá bỏ tổ chức để thu
enzyme và quá trình bảo quản rất phức tạp. Trong khi đó các vi sinh vật đặc biệt là
vi khuẩn có chứa rất nhiều loại enzyme có hoạt tính cao. Chúng lại có khả năng
chuyển hóa các chất và sinh sản nhanh, nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn lại
thường rẻ tiền, người ta có thể dể dàng điều khiển sự tổng hợp enzyme từ các nguồn
nguyên liệu khác nhau hẳn [12].
Vì vậy vi sinh vật là nguồn thu enzyme rất tiềm năng. Trong các nguồn thu
protease từ vi sinh vật có nhiều triển vọng nhất là việc thu protease từ vi khuẩn
Bacillus subtilis vì loài vi khuẩn này rất phổ biến dễ phân lập, thu enzyme và enzyme
thường có hoạt tính cao và có nhiều ưu thế hơn hẳn (Nguyễn Thị Hiền và cs 2004) [7].
1
Từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Phân lập tuyển
chọn các chủng của Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao làm cơ sở
cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn được các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh
protease làm cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa khoa học
Phân lập được loài vi khuẩn Bacilussubtilis từ đất, tuyển chọn được chủng có
khả năng sinh protease. Biết và hiểu rõ hơn về các thoa tác kĩ thuật cũng như các thông
số quy trình công nghệ trong quá trình thực hiện đề tài.
- Ý nghĩa thực tiễn
+ Làm tiền đề cho việc sản xuất chế phẩm sinh học, đáp ứng yêu cầu càng cao
của ngành chăn nuôi.
2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát hiện
của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia
phóng xạ [1].
- Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Trên môi trường thạch đĩa MPA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều,
có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn
nheo, màu hơi nâu.
Trên môi trường thạch nghiêng MPA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn
gợn sóng.
Trên môi trường gelatin: khuẩn lạc phát triển và làm tan chảy gelatin.
Trên thạch khoai tây: khuẩn lạc phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt.
Trên môi trường canh MPA: khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển
làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên
khó tan đều. [1].
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy
Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu
trong môi trường thiếu oxy. Chúng phát triển tốt trên môi trường MPA với nhiệt độ
tối ưu là 37
o
C, pH = 7,0 - 7,4 [19].
4
2.1.5. Đặc điểm sinh hoá
Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol,
saccharose, xylose, arabinose. Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H
2
S (-), NH
3
(+),
catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+).
Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis
Phản ứng sinh hoá Kết quả
dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) [1].
Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất.
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập
trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo
thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp
màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào
dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều
kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ
và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra
một bào tử [1].
2.2. Giới thiệu về enzyme protease
2.2.1. Tổng quan về enzyme Protease
Protease là enzyme thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử
protein giải phóng các acid amin, pepton hoặc ditripepton.
Nhóm enzyme protease (peptit-hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thủy phân liên
kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là
các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và
vận chuyển axit amin. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức
năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều
đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virut) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và
động vật (gan, dạ dày bê…). So với protease động vật và thực vật protease vi sinh
vật có những đặc điểm rất khác biệt. Trước hết hệ enzyme protease của vi sinh vật
là 1 hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối
lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng đồng nhất. Cũng do đó
6
nên protease visinh vật thường có tính đặc hiệu cao, cho sản phẩm thủy phân triệt
để và đa dạng [2].
2.2.2 Phân loại và đặc điểm của protease
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, thủy phân liên kết peptid CO-NH
của phân tử protein và peptid thành các axit amin tự do và một ít peptid khối lượng
động của chúng có những ion kim loại. Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng
pH trung tính.
2.2.2.3 Phân loại theo pH tác dụng tối ưu của protease
Theo Nguyễn Đức Lượng và cs (2004) [12], dựa vào pH hoạt động của các
protease người ta chia protease ra thành 3 loại:
- Protease acid: hoạt động trong khoảng 3-3,8.
- Protease base: hoạt động trong khoảng 8,5-8,9.
- Protease trung tính.
Tuy nhiên, tác động tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của Cơ
chất vì cùng một loại protease của một chủng vi khuẩn, khi thủy phân casein,
hemiglobin, gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau.
2.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật
Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật có
thể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật.
Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có
trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ.
Protease nội bào : cho đến nay các protease nội bào còn đang được nghiên
cứu và cũng chưa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào.
Theo Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005 [15], các protease nội bào có thể có vai trò
quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức năng sau:
Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các acid amin để
tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn Cacbon, nito, lưu huỳnh.
8
Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này có
thể có nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật.
Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide
đã được tổng hợp. Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các
protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến, hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình
sinh trưởng của vi sinh vật.
2.2.4. Tính ưu việt và các ứng dụng của protease vi sinh vật
Protease được sử dụng để làm trong bia và nước ép trái cây. Được sử dụng
trong quá trình sản xuất rượu giúp phân giải các protein có tác dụng kìm hãm
amylase do đó làm tăng quá trình đường hóa tinh bột [7].
2.2.4.3. Trong công nghiệp thuộc da
Protease còn được sử dụng để làm mềm da, tăng cường khả năng tách lông ra
khỏi da mà không là ảnh hưởng đến chất lượng da, vì vậy, da thu được sẽ mềm và
sạch lông hơn [12].
2.2.4.4. Trong mỹ phẩm
Protease được sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm,
kem bôi mặt Do nó có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn. các
loại xà phòng có chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như:
vết máu khá tốt [12].
2.2.4.5. Trong nông nghiệp
Protease được sử dụng để xử lý các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho vật
nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hệ số sử dụng thức ăn, có thể tiến
hành bằng cách thêm trực tiếp protease vào thức ăn trước khi dùng hoặc dùng
protease để xử l ý sơ bộ thức ăn [17].
2.2.4.6. Trong nghiên cứu khoa học
Được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc protein
2.2.4.7. Trong công nghiệp dược phẩm và y học
Sản xuất các chất hoạt hóa và kiềm hãm protease để điều trị các bệnh đặc
trưng. Protease được sử dụng để tăng khả năng tiêu hóa protein ở những người bị
tiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường do thiếu enzyme.
10
Protease còn được sử dụng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể để
chữa bệnh nghẽn tỉnh mạch. Protease được sử dụng để làm tiêu mủ ở các vết
thương, các ổ viêm, làm thông đường hô hấp [12]
2.2.4.8. Trong xử lý rác
Hiện nay đất nước đang ngày càng phát triển, dân số tăng nhanh, khối lượng
chất thải đặc biệt là rác hữu cơ trong công nghiệp, nông nghiệp và sinh hoạt tăng rất
và thực vật có trong rác hữu cơ [16]. Để giải quyết vấn đề bảo vệ môi trường sống,
đồng thời tận dụng phế liệu sản xuất ra những vật liệu quan trọng cho các ngành.
Một trong những biện pháp tốt nhất là tái xuất phế thải làm phân bón hữu cơ, giá
thể trồng nấm, nuôi giun Trong rác có chứa một số chất hữu cơ, cũng như các yếu
tố dinh dưỡng dùng để bổ sung độ phì nhiêu cho đất và làm tăng thu hoạch cây
11
trồng. trung bình trong 10 tấn rác có 900-1900kg chất hữu cơ theo hướng này rác có
thể ủ thành đống, tại đây sẽ xảy ra các quá trình phân giải các chất hữu cơ của vi
sinh vật. Nhiệt độ của các đống ủ khoảng 50
o
C. Muốn cho quá trình ủ rác diễn ra
nhanh hơn người ta cho thêm vào đó các loại vi khuẩn như Streptomyces,
Azotobacter, một số nấm mốc như Rhizobium.
Ở nước ta hiện nay đã có những nhà máy ủ phân rác để bổ sung chất hữu Cơ
cho nông nghiệp như nhà máy DANO (hooc môn) công suất 5 tấn/ ngày. Tại đây ủ
phân rác dựa trên các tác động phân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật. Các điều kiện
bên ngoài có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi sinh vật trong quá trình ủ rác.
Do đó phải tạo điều kiện cần thiết nhằm thúc đẩy mạnh hoặc khống chế hoạt động
của vi sinh vật làm cho rác hoại kỹ hơn, đỡ mất chất dinh dưỡng.
2.2.4.9. Trong kỹ nghệ phim ảnh
Protease từ vi khuẩn được sử dụng để tái sinh các nguyên liệu cảm quan khác
nhau như phim điện ảnh, phim rơnghen, phim chụp. Nó sẽ phân giải và hòa tan lớp
nhủ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại
các loại phim và giấy ảnh quí.
2.2.5. những nghiên cứu phân lập, tuyển chon, thu nhận enzyme protease từ
Bacillus nói chung và Bacillus subtilis nói riêng.
2.2.5.1 Trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thu nhận protease từ vi khuẩn
Bacillus subtilis làm cơ sở để sản xuất các sản phẩm sinh học phục vụ cho con
người và các động vật.
3.2.1. Thời gian : 23/12/2013 – 31/5/2014
3.2.2. Địa điểm
Bộ môn công nghệ vi sinh – Viện Khoa Học sự sống – Đại Học Nông Lâm
Thái Nguyên.
3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng
3.3.1. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 3.1 dưới đây:
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Xuất xứ STT
Tên hóa
chất
Xuất xứ
1
Pepton Tây Ban Nha
8
KH
2
PO
4
Mỹ
2
Cao thịt Tây Ban Nha
9
CH
3
COONa Trung Quốc
3
Cao nấm men Pháp
10
MgSO
STT Tên thiết bị Xuất xứ STT Tên thiết bị Xuất xứ
1
Nồi hấp
thanh trùng
Sanyo-Nhật
9
Lò vi sóng Bio-RAD-Mỹ
2 Tủ sấy
MMM Medcenter
Einrichtungen
GmbH-Đức
10
Tủ lạnh sâu
(-80
o
C)
Sanyo-Nhật
3 Tủ ấm
MMM Medcenter
Einrichtungen
GmbH-Đức
11
Máy đo quang
phổ
Bio-RAD-Mỹ
4
Tủ cấy vi
sinh
Euroclone S.p.A-
Bio Air Division-
Bảng 3.3: Thành phần môi trường MPA dạng thạch
Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng
Cao thịt 5g Agar 18g
Pepton 10g Nước cất 1 lít
NaCl 5g pH 7
Hấp khử trùng ở 121
0
C trong 15 phút
Bảng 3.4: Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease [19],[30]
Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng
Pepton 0,20 g MnSO
4
.4H
2
O 0,10g/l
Casein 4,00g NaCl 3,00g
Glucoza 0,05g K
2
HPO4 1,50g
KH
2
PO4 1,50g Agar 15,00g
Nước cất 1000ml hấp Khử trùng ở 121
o
C 1atm/15 phút
Bảng 3.5: Môi trường thử hoạt tính của enzyme protease [24]
Môi trường cơ sở
Thành phần Hàm lượng
Pepton 5,0g/l
Cao nấm men 2,5g/l
4
H
2
PO4 1,00g
Agar 18,00g
Nước cất 1000ml
pH 6,9 ± 0,2, hấp khử trùng 121
o
C trong 10 phút
Bảng 3.8: Môi trường khử nitrate
Thành phần Hàm lượng
Cao thịt 3g
Pepton bột 5g
NaNO
3
1g
Agar 7g
Nước cất 1000ml
pH = 7,0 ± 0,2, hấp khử trùng 121
o
C trong 10 phút
Bảng 3.9: Môi trường lòng đỏ trứng
Thành phần Hàm lượng
Cao thịt 1g
Pepton bột 10g
Manitol 10g
NaCl 10g
Phenol Red 0,0025g
Agar 15g
Nước cất 1000ml
Rượu etylic : 300ml
Xanh metylen : 20g
Hòa tan hổn hợp trên rồi lọc trong :
Dịch lọc : 30ml
KOH 1% : 1ml
Nước cất : bổ sung đến 1000ml
+ Đỏ trung tính 0.5%
Đỏ trung tính : 0.5g
Nước cất : bổ sung đến 100ml
Lọc trong trước khi dùng
3.4. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất
+ Quan sát hình thái khuẩn lạc
+ Nhuộm Gram quan sát hình thái tế bào
+ Thử các phản ứng sinh hóa để tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
- Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh protease cao
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh
trưởng và tạo enzyme của các chủng vi khuẩn tuyển chọn được.
3.5. Phương pháp thực hiện đề tài
3.5.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất
18
3.5.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn
Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất ở dưới.
Cân 10g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lí vô
trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10
-1
.
3.5.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được phân lập từ đất theo phương pháp của Nguyễn Lân
Dũng và Hoàng Đức Nhuận (1976) [3] như sau:
C, sau 24h thấy xuất hiện
khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 4
o
C giữ giống.
Giống được cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống.
3.5.1.4 Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường rắn MPA theo
phương pháp của Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận (1976) [3]
19
Copyright: Tài liệu đại học ©