BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC GIỐNG VI SINH VẬT SINH
PROTEASE VÀ GÂY HƢƠNG MẮM ĐẶC TRƢNG TỪ
CHƢỢP MẮM VÀ ỨNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT
NƢỚC MẮM CHAY TỪ NẤM
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khoá: 2003 – 2007

NƢỚC MẮM CHAY TỪ NẤM
Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
ThS. VƢƠNG THỊ VIỆT HOA TRẦN THỊ ANH THẢO
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007iii LỜI CẢM TẠ

Chúng tôi xin chân thành cảm tạ:
Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm
Bô Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi

từ thí nghiệm 1 và bố trí trên môi trường nước chiết nấm rơm có 20% muối. Thời
gian theo dõi sau 24 giờ, khảo sát khả năng hàm lƣợng đạm formol đƣợc sinh ra
bằng phƣơng pháp chuẩn độ formol.
Thí nghiệm 4: khảo sát khả năng sinh hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập
đƣợc từ thí nghiệm 1 trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm có 20% muối. Thời gian
theo dõi sau 3 ngày, ghi nhận kết quả qua phép thử cho điểm bằng phƣơng pháp
đánh giá cảm quan.
Thí nghiệm 5:Sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi sinh vật
phân lập đƣợc.
Nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân là 40
0
C-50
0
C.
Tỉ lệ phối trộn của dứa từ 15% đến 45%. v Sản phẩm nƣớc mắm chay có bổ sung vi khuẩn gây hƣơng Clostridium.sp và vi
khuẩn thủy phân Bacillus.sp đƣợc phân lập và tuyển chọn từ các thí nghiệm 1, thí
nghiệm 2, thí nghiệm 3, thí nghiệm 4 để cho ra sản phẩm có giá trị cảm quan cao
nhất.
Kết quả thu đƣợc:
Tất cả các chủng đều có khả năng chịu mặn.
Chủng Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 đƣợc chọn làm tác nhân thủy phân.
Chủng Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 đƣợc chọn làm tác nhân sinh hƣơng.
Nghiệm thức 5 với công thức phối trộn giữa các thành phần nguyên liệu là 45% dứa
+ 20% nấm rơm + 20% nấm bào ngƣ + 15% muối + 10% canh khuẩn vi khuẩn hiếu

rd
experiment: Survey possibility of salt-resistant of bacteria that
isolated on Volvariella volvacea extract culture with 20% salt. Survey hydrolys of
protein by title of formol method after 24 hours.
The fourth experiment: Survey possibility of hydrolysis of bacteria that
isolated on Volvariella volvacea extract culture with 20% salt. Result is evaluated
by sense organs method.
The fifth experiment: Producing experimentally vegetarian fish sauce from
mushroom.
T
0
opt
: 40
0
C – 50
0
C.
Ratio of pineapple: 15% - 45%.
Vegetarian fish sauce is supplemented Clostridium sp and Bacillus sp that are
isolated and selected from the 1
st
experiment, the 2
nd
experiment, the 3
rd
experiment
and the fourth experiment.

Danh sách các sơ đồ, hình , đồ thị xiii
1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích, nội dung và giới hạn đề tài 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Nội dung nghiên cứu 2
1.2.3. Giới hạn đề tài 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1. Khái quát về nƣớc mắm 4
2.1.1 Giới thiệu 4
2.1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình hình thành nƣớc mắm 4
2.1.3 Giá trị dinh dƣỡng của nƣớc mắm 7
2.2. Cơ chế hình thành nƣớc mắm 7
2.2.1. Quá trình chuyển hóa protid thành acid amin 7
2.2.2. Quá trình tạo hƣơng thơm 8
2.3. Quy trình sản xuất nƣớc mắm 8
2.3.1. Quy trình sản xuất nƣớc mắm dài ngày 8
2.3.2. Quy trình sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày 10
2.4. Giá trị dinh dƣỡng của nấm ăn 13 ix 2.5. Sự phân giải của enzyme 18
2.5.1. Phân loại protease 18
2.5.2. Một số nguồn enzyme đƣợc sử dụng 19
2.5.2.1. Protease từ vi sinh vật 19
2.5.2.2.Protease từ thực vật – enzyme bromelin 20
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

4.1.2. Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập
đƣợc 37
4.1.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập
đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm 40
4.1.4. Kết quả khảo sát khả năng sinh hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập
đƣợc 43
4.2. Kết quả sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi khuẩn
phân lập đƣợc 44
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56
5.1. Kết luận 56
5.2. Đề nghị 57
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 68
7. PHỤ LỤC xi DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Thành phần hóa học của nƣớc mắm 7
Bảng 2.2. So sánh thành phần nƣớc mắm ngắn ngày có dùng thêm chế phẩm
enzyme vi sinh vật và nƣớc mắm dài này theo phƣơng pháp thông thƣờng 12
Bảng 2.3. Thành phần phân tích của một số nấm trồng phổ biến 14
Bảng 2.4. Hàm lƣợng vitamine và chất khoáng 14
Bảng 2.5. Thành phần acid amin trong nấm 14
Bảng 3.1. Bảng tiêu chuẩn cho điểm về khả năng gây hƣơng của các chủng vi
sinh vật trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm 28
Bảng 3.2. Bảng chỉ tiêu cảm quan nƣớc mắm 31

xiii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH , ĐỒ THỊ

SƠ ĐỒ TRANG


Đồ thị 4.7. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan mùi giữa các nghiệm thức 50
Đồ thị 4.8. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan vị giữa các nghiệm thức 51
Đồ thị 4.9. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan độ trong giữa các nghiệm thức 51
1 Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1.Đặt vấn đề.
Trung Quốc có nƣớc tƣơng, Việt Nam có nƣớc mắm. Từ lâu nƣớc mắm đã trở
thành một loại nƣớc chấm rất thông dụng và gần gũi với ngƣời dân Việt Nam,
những ai đi xa khi nhớ đến quê hƣơng thì không thể quên hƣơng vị của nƣớc mắm
quê nhà. Ngƣời nƣớc ngoài thì biết đến nƣớc mắm nhƣ món ăn truyền thống của
ngƣời Việt Nam, đã có bài báo so sánh nƣớc mắm đối với Việt Nam giống nhƣ
rƣợu cônhắc đối với nƣớc Pháp.Vừa đƣợc xem là loại gia vị vừa đƣợc xem là thực
phẩm giàu dinh dƣỡng, nó chứa nhiều acid amin không thay thế nhƣ lysin,
valin…các vitamine hoà tan trong nƣớc B1, B2, PP…và các nguyên tố Ca, P, S…
Khi xã hội phát triển,chất lƣợng cuộc sống ngày càng đƣợc nâng cao thì con
ngƣời luôn đòi hỏi đến các loại thực phẩm không chỉ về chất lƣợng và mùi vị, mà
còn phải đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nhƣng vẫn giữ đƣợc giá cả hợp lý. Và
những yêu cầu này không loại trừ nƣớc mắm.
Ngoài ra vấn đề cạnh tranh giữa các hãng nƣớc mắm không chỉ trong nƣớc mà
còn ngoài nƣớc nhƣ Thái Lan thì các yêu cầu trên càng đƣợc quan tâm hơn. Trong
khi đó, công nghệ sản xuất nƣớc mắm ở Viêt Nam còn mang tính thủ công, hiệu
suất lên men thấp, thời gian lên men kéo dài và đây cũng là nhƣợc điểm lớn nhất. Vì

Tuyển chọn các vi khuẩn sinh protease và gây hƣơng từ các chủng vi khuẩn
đã đƣợc phân lập qua khảo sát khả năng phân giải đạm và gây hƣơng trong dịch
chiết nấm rơm.
Ứng dụng các chủng vi sinh vật sinh protease và gây hƣơng để chế biến
nƣớc mắm chay ngắn ngày từ nguyên liệu nấm rơm và nấm bào ngƣ làm đa
dạng sản phẩm nƣớc mắm, tạo sản phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao, đáp ứng nhu
cầu an toàn thực phẩm.
1.2.2.Nội dung nghiên cứu.
Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện trong chƣợp mắm.
Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trong
chƣợp mắm trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm.
3 Tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh protease qua khảo sát khả năng thủy
phân protein của các chủng vi sinh vật phân lập trong chƣợp mắm trên nguyên
liệu nƣớc chiếtt nấm rơm.
Khảo sát khả năng gây hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập trong
chƣợp mắm trên nguyên liệu nƣớc chiết nấm rơm.
Sản xuất thử nghiệm nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi
khuẩn phân lập và tuyển chọn đƣợc.
1.2.3. Giới hạn đề tài.
Đề tài chỉ bƣớc đầu phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh thủy
phân tốt và gây hƣơng mắm đặc trƣng trên dịch chiết nấm rơm từ đó ứng dụng
vào sản xuất nƣớc mắm chay ở quy mô phòng thí nghiệm.
Do thiếu hóa chất để thực hiện một số phản ứng sinh hóa nên đề tài chỉ
dừng lại ở mức định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn.

thủy phân nhanh hơn. Lƣợng nƣớc cho vào trong quá trình thủy phân, theo kinh
nghiệm của các xí nghiệp sản xuất nƣớc chấm cho thấy lƣợng nƣớc cho vào thủy
phân tốt nhất là 30 – 40% so với nguyên liệu, khi cho nƣớc vào nên cho 5 – 10%
muối NaCl và duy trì nhiệt độ thủy phân 54
0
C – 58
0
C trong suốt thời gian lên men
5 là 64 – 72 giờ. ( Nguyễn Đức Lƣợng, 2006)
Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nƣớc chấm, thiếu
muối nƣớc chấm sẽ không hình thành đƣợc.
Yêu cầu của muối trong quá trình sản xuất nƣớc chấm phải là muối ăn
(NaCl), muối càng tinh khiết càng tốt. Tốt nhất là muối kết tinh hạt nhỏ, có độ
rắn cao, màu trắng óng ánh không đóng cục, không có vị đắng chát.
Nồng độ muối thấp có tác dụng thúc đẩy quá trình thủy phân protein
nhanh hơn, tạo thành acid amin nhiều hơn.
Nồng độ muối cao có tác dụng ức chế, làm mất hoạt tính của enzyme,
quá trình thủy phân chậm lại, thời gian thủy phân kéo dài.
Thƣờng lƣợng muối cho vào quá trình lên men khoảng 20 – 25% so với
lƣợng nƣớc. Nên thực hiện phƣơng pháp cho muối nhiều lần và cần phải xác
định số lần cho muối vào và khoảng cách giữa các lần cho muối để không ảnh
hƣởng đến quá trình lên men.
Nồng độ muối ảnh hƣởng mạnh mẽ đến vi sinh vật. Nồng độ muối cao
sẽ ức chế vi sinh vật phát triển. Còn nồng độ muối thấp thì mốc dễ dàng phát

Staphilococcus aureus, vi khuẩn yếm khí: Clostridium Tonkimeirs, Clostridium
welchii, Eubacterium; nấm mốc: Aspergillus Penicillium, Mucor; nấm men:
Trichoderma, Tropicalis…
Năm 1930, Boer và Guiller đã tách đƣợc từ nƣớc mắm một loại vi khuẩn kị
khí sinh bào nha là Clostridium. Loại này cấy trong môi trƣờng thạch pepton sẽ sản
sinh ra hƣơng vị của nƣớc mắm.
Thêm chƣợp chín cũng có tác dụng rút ngắn ¼ - ½ thời gian trong điều kiện
36
0
C – 44
0
C. Đồng thời phải cho muối từ nhạt đến mặn dần để lợi dụng khả năng
lên men ban đầu của vi sinh vật, không làm ức chế các men hoạt động.
Áp dụng phƣơng pháp cho muối nhiều lần sẽ phân giải nhanh hơn cho muối 1
lần.
Nguyên liệu đƣợc băm, nghiền, đập dập có tác dụng rút ngắn đƣợc thời gian
chế biến chƣợp hơn cá nguyên con.
Nghề nƣớc mắm hiện nay ở Việt Nam vẫn sản xuất theo phƣơng pháp cổ
truyền quá trình sản xuất thô sơ, thời gian kéo dài và hiệu quả kinh tế thấp. Đã có
nhiều công trình nghiên cứu để cơ giới hóa nghề nƣớc mắm nhƣng còn gặp nhiều
khó khăn và hạn chế vì sự ăn mòn của muối đối với kim loại. 7

amon
7,6
3,1
3,2
2,1
N
2
formol
18,3
10,6
9,4
4,5
N
2
hữu cơ
19
8,3
10,5
6
N
2
amin
10,7
7,5
6,2
2,4
Tryptophan
1,05
0,64
0,45

,…Các sản phẩm này làm giảm chất
lƣợng nƣớc mắm, bay hơi tạo mùi khó chịu. Những vi sinh vật tiết ra enzyme
protease thúc đẩy quá trình thủy phân xảy ra nhanh hơn. Bên cạnh đó các vi sinh vật
8 gây thối có tác dụng ngƣợc lại làm nát thịt cá và gây thối sản phẩm, những vi sinh
vật này xuất hiện có khi ở giai đoạn đầu hay trong trong quá trình chế biến nếu
không khống chế kịp thời sau khi tạo thành nƣớc mắm cũng dễ bị thối do vi sinh vật
gây nên.
2.2.2.Quá trình tạo hƣơng thơm.
Đây là một quá trình phức tạp, đòi hỏi phải có thời gian nhất định để sản phẩm
tích lũy năng lƣợng đặc trƣng do sự chuyển hóa các hợp chất hữu cơ tạo thành
hƣơng thơm.
Nƣớc mắm là một dung dịch mà trong đó không chỉ có acid amin, nƣớc, muối,
vitamine và các chất khoáng mà phải có loại hƣơng thơm đặc trƣng của nó. Do đó
nếu thiếu quá trình này thì nƣớc mắm không còn là nƣớc mắm mà chỉ là dung dịch
acid amin thuần túy.
Cho đến nay vẫn chƣa có sự giải thích rõ ràng nào về sự tạo hƣơng nƣớc mắm,
nhiều ngƣời cho rằng các sản phẩm thủy phân trong quá trình kết hợp với nhau mà
sinh hƣơng, một số khác thì cho ràng là do hoạt động của vi khuẩn lactid hoặc vi
khuẩn thuộc giống Clostridium nhƣ công trình nghiên cứu cùa Boer và Guiller
(1930), Creach và Koskopull (1940)…
2.3.Quy trình sản xuất nƣớc mắm.
2.3.1.Quy trình sản xuất nƣớc mắm dài ngày.
Đây là phƣơng pháp làm nƣớc mắm thủ công, quá trình này thƣờng kéo dài
12 – 14 tháng để làm chuyển hóa protein của cá thành acid amin rùi đem lọc và nấu

Bã

Làm phân bón hoặc làm thực phẩm gia súc
Sơ đồ 2.1. Quy trình tổng quát công nghệ sản xuất nƣớc mắm dài ngày.
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2006).

Một số điểm lưu ý trong công nghệ sản xuất:
*Cho muối trong quá trình lên men
Cho muối thành nhiều lần khác nhau: Cơ sở khoa học của phƣơng pháp này là:
Làm cho enzyme protease không bị ức chế bởi nồng độ muối cao, ngay từ đầu
ở nồng độ muối thấp quá trình thủy phân xảy ra với tốc độ cao hơn.
Kiềm hãm hoạt động của các vi sinh vật gây thối. Nếu với nồng độ muối cao
thịt cá sẽ chắc lại khó thủy phân, do vậy làm chậm tốc độ thủy phân cá.
10 *Sự cho nước thêm vào chượp:
Điều này có tác dụng làm loãng nồng độ muối, làm loãng chƣợp tạo điều kiện
cho các enzyme hoạt động tốt, dễ khuấy trộn, thịt cá chóng nát, nhiệt độ phân phối
đều trong chƣợp.
Tuy nhiên, việc cho nƣớc thêm vào chƣợp dễ tạo điều kiện xâm nhập hoạt
động của các vi sinh vật gây thối. Do đó cần theo dõi quá trình sản xuất để phát hiện
các hiện tƣợng bất thƣờng, tạo mùi thối, vị xấu để bổ sung muối kịp thời ngăn
chặn sự hƣ hỏng của chƣợp cá.
*Tác dụng phơi nắng:
Tạo điều kiện thích hợp cho enzyme hoạt động làm tăng tốc độ thủy phân.
Chƣợp càng phơi nắng nhiều nƣớc mắm càng ngon, càng rút ngắn đƣợc thời

Ƣớp muối

Lên men

Lọc

Bã Dùng chăn nuôi, làm phân bón

Nƣớc mắm nguyên chất

Pha chế

Thành phẩm
Sơ đồ 2.2. Quy trình tổng quát công nghệ sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày
( Nguyễn Đức Lƣợng, 2006)

Một số điểm lưu ý trong công nghệ sản xuất:
*Tăng lượng enzyme từ bên ngoài bổ sung enzyme vào cần hỗ trợ cho enzyme
protease của vi sinh vật ruột cá
Nguồn enzyme bên ngoài có thể lấy từ thực vật nhƣ bromelin của dứa, từ động
vật nhƣ pepsin từ niêm mạc dạ dày, enzyme protease khác từ tụy tạng, ruột non…
protease từ chƣợp cá đã chín của các mẻ nƣớc mắm trƣớc. Hiện nay ở nƣớc ta
ngƣời ta áp dụng biện pháp sử dụng các chế phẩm enzyme protease vi sinh vật. Các