Website: http://www.docs.vn Email : [email protected] Tel (: 0918.775.368
đại học quốc gia hà nội
Trờng đại học khoa học tự nhiên
--------------------
Nguyễn Thị Tuyền
Vi khuẩn oxy hóa fe(ii) và khử nitrate ở việt nam:
tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng
Luận văn thạc sĩ khoa học
Hà Nội - 2009
đại học quốc gia hà nội

Website: http://www.docs.vn Email : [email protected] Tel (: 0918.775.368
Trờng đại học khoa học tự nhiên
--------------------
Nguyễn Thị Tuyền
Vi khuẩn oxy hóa fe(ii) và khử nitrate ở việt nam:
tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40
Luận văn thạc sĩ khoa học
Ngời hớng dẫn khoa học: ts. đinh thúy hằng
Hà Nội - 2009
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

Lời cảm ơn
Đề tài luận văn đợc thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Đặc biệt cấp Đại
học Quốc gia Hà Nội, mã số QG.07.23.
Để có thể hoàn thành luận văn này, trớc tiên, tôi muốn bày tỏ lỏng biết ơn sâu
sắc tới Tiến sĩ Đinh Thúy Hằng, Trởng phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã định hớng nghiên cứu, trực tiếp hớng

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid...........................................................................7
FISH Fluorescence in situ hydridization..........................................................................7
MQ Mili-Q....................................................................................................................................7
MPN Most probable number.................................................................................................7
OD Optical density..................................................................................................................7
PBS Phosphate-buffered saline..........................................................................................7
PCI Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol............................................................................7
PCR Polymerase chain reaction..........................................................................................7
rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid.............................................................................7
RNA Ribonucleic acid..............................................................................................................7
rRNA Ribosomal ribonucleic acid........................................................................................7
SDS Sodium dodecyl sulfate...............................................................................................7
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

TAE Tris-Acetic-EDTA (đệm)..............................................................................................7
TE Tris-EDTA (đệm)................................................................................................................7
Taq Thermus aquaticus DNA...............................................................................................7
UV Ultraviolet............................................................................................................................7
Mở đầu............................................................................................................................................1
Chơng 1- Tổng quan tài liệu.....................................................................................................3
1.1. Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn...........................................................................3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn oxy hóa Fe(II) (FOM).................................3
1.1.2. Vai trò của vi khuẩn trong chu trình oxy hóa - khử sắt.............................4
1.1.3. Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính....................................5
1.1.4. Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hóa Fe(II) ..............................................6
1.1.5. Vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) ...............................................................6
1.2.Khử nitrate nhờ vi khuẩn..................................................................................................7
1.3. Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate..............................................................................8
1.4. Cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe(II) và các gen liên quan..............................9

3.2. Phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn bằng điện di biến tính (DGGE)................34
3.3.Đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn trong các môi trờng nghiên cứu bằng phơng pháp
FISH......................................................................................................................................35
3.4. Mức độ oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu.........37
3.5. Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu ......................38
3.6. Đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate
bằng phơng pháp ARDRA....................................................................................................40
3.7. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân loại và hoạt tính sinh học của các chủng vi
khuẩn đại diện.....................................................................................................................43
Kết luận......................................................................................................................................49
hớng nghiên cứu tiếp theo....................................................................................................50
Tài liệu tham khảo....................................................................................................................51
Phụ lục........................................................................................................................................62
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

danh mục các chữ viết tắt
ARDRA Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis
bp Base pair
BSA Bovin serum albumin
DNA Deoxyribonucleic acid
CI Chloroform-isoamyl alcohol
CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide
DAPI 46-diamidino-2-phenylindole
ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate
DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
FISH Fluorescence in situ hydridization
MQ Mili-Q

(Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998; Weber và cs, 2006 c). Quá trình oxy hóa
Fe(II), khử nitrate đợc tóm tắt nh sau:
10 Fe
2+
+ 2 NO
3

+ 24 H
2
O = 10 Fe(OH)
3
+ N
2
+ 9 H
2

Trong tự nhiên, quá trình oxy hóa Fe(II) với chất nhận điện tử là nitrate chủ
yếu diễn ra ở ranh giới hiếu khí (có oxy) và kỵ khí (không có oxy) trong lớp trầm
tích ở đáy các thủy vực. Oxy hóa Fe(II) kết hợp với khử nitrate có thể đóng vai trò
quan trọng trong môi trờng ô nhiễm với nồng độ Fe(II) cao (do thiếu oxy) và nitrate
cao (do chất hữu cơ bị phân hủy tạo thành) (Weber và cs, 2006 c). Các loài vi khuẩn
với khả năng tiến hành phản ứng oxy hóa khử này có thể cùng một lúc thực hiện đợc
hai nhiệm vụ, thứ nhất là chuyển Fe(II) hòa tan trong nớc về dạng Fe(III) kết tủa, và
hai là loại bỏ nitrate, chuyển thành dạng N
2
không độc hại.
Vi khuẩn dùng ion Fe(II) làm nguồn cho điện tử để khử nitrate đợc phân lập
đầu tiên từ các lớp trầm tích ao, hồ nớc ngọt tại Bremen, Đức năm 1996 (Straub và
cs, 1996). Một số công trình nghiên cứu tiếp sau cho thấy sự có mặt khá phổ biển
của nhóm vi khuẩn này với mật độ khá cao (10

Chuyên ngành Vi sinh vật học
2
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

Chơng 1- Tổng quan tài liệu
1.1. Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn oxy hóa Fe(II) (FOM)
Khái niệm vi sinh vật liên quan đến oxy hóa sắt có từ nửa đầu thế kỉ 19, khi
Ehrenberg cho rằng các quặng sắt có thể đợc hình thành do kết quả của hoạt động
sinh học. Vi khuẩn liên quan trực tiếp đến sắt oxit, Gallionella ferruginea, cũng đã
đợc ông mô tả một cách chi tiết (Ehrenberg, 1919). Trong suốt thời gian sau đó,
nhiều đối tợng vi sinh vật đã đợc sử dụng để chứng minh rằng vi khuẩn có khả năng
oxy hóa sắt ở pH trung tính ví dụ nh Leptothrix ochracea (Kỹtzing, 1919). Tuy
nhiên vào thời điểm đó các bằng chứng đa ra vẫn cha đợc hoàn toàn xác thực. Cũng
vào thời điểm này, Harder, một giáo viên địa chất ngời Mỹ đã công bố một công
trình nghiên cứu về vi khuẩn sắt (Harder, 1919), trong đó vi khuẩn đợc chứng minh
là một trong các yếu tố địa hóa của chu trình sắt. Những vi khuẩn mà Harder đề cập
này sau đó đợc phát hiện trong một vài môi trờng nớc ngọt và phơng pháp làm giàu
cũng đợc sử dụng để cung cấp các bằng chứng cụ thể về hình thức sinh trởng tự d-
ỡng vô cơ của nhóm vi khuẩn này. Tuy nhiên vào thời điểm đó, chủng đơn vẫn cha
phân lập đợc.
75 năm sau đó, nhiều nghiên cứu đã cung cấp các hiểu biết về tập tính của vi
sinh vật oxy hóa Fe(II) (FOM- Ferrous oxidizing Microbiology) cũng nh vai trò
quan trọng của chúng trong phản ứng địa hóa và ăn mòn sinh học. Mặc dù vậy số
chủng phân lập đợc còn giới hạn, do đó mức độ đa dạng, phân loại, hình thái cũng
nh sinh lý của nhóm vi khuẩn này vẫn cha đợc mô tả chi tiết (Emerson, 2000). Năm
1984, tổng quan của Ghiorse đã thảo luận nhiều vấn đề về pháp danh và phân loại
của nhóm vi khuẩn này (Ghiorse, 1984). Quá trình oxy hóa Fe(II) kỵ khí mới đợc
biết đến nhờ việc phân lập đợc vi khuẩn tía quang hợp không lu huỳnh, có khả năng
sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Widdel và cs, 1993). Tiếp sau đó, vào năm

2
)
trong môi trờng kỵ khí có tính acid yếu đến môi trờng trung tính (Straub và cs,
2001). Trớc khi phản ứng oxy hóa khử nhờ vi khuẩn đợc phát hiện ra thì cơ chế vô
sinh đã đợc cho là chi phối quá trình oxy hóa khử sắt trong môi trờng. Tuy nhiên,
đến nay thì rõ ràng là sự chuyển hóa sắt chủ yếu là do vi khuẩn điều khiển trong hầu
hết các điều kiện môi trờng. Nhiều loài vi khuẩn, kể cả vi khuẩn cổ, có khả năng sử
dụng thế oxy hóa khử của cặp Fe(II)/Fe(III) (+770 mV đối với môi trờng acid; +200
mV đối với môi trờng trung tính) và các cặp oxy hóa - khử khác để trao đổi điện tử,
tạo năng lợng. ở đây, Fe(II) đợc sử dụng nh là chất cho điện tử để cung cấp đơng l-
ợng khử cho các quá trình đồng hóa carbon thành sinh khối nhờ các vi khuẩn oxy
hóa Fe(II) trong cả điều kiện kỵ khí và hiếu khí, còn Fe(III) có thể đợc sử dụng nh là
chất nhận điện tử cuối cùng trong điều kiện kỵ khí cho các vi khuẩn tự dỡng vô cơ
và tự dỡng hữu cơ khử Fe(III) (Weber và cs, 2006 a).
Mặc dù vai trò của quá trình chuyển hóa sắt nhờ vi khuẩn trong môi trờng là
rất lớn nhng những hiểu biết của chúng ta về sinh lý, sinh hóa của chúng vẫn còn
giới hạn. Hầu hết các nghiên cứu và công bố về quá trình oxy hóa Fe(II) đều tập
Chuyên ngành Vi sinh vật học
4
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

trung vào các vi khuẩn hiếu khí, a acid nh Thiobaccillus ferrooxidans (Temple và
Colmer, 1951; Yamanaka và Fukumori, 1995), là vi khuẩn phát triển trong môi tr-
ờng có pH 1-2 và tồn tại Fe(II) và Fe(III) ở dạng ion hòa tan. Tuy nhiên, ở pH trung
tính cơ chất và sản phẩm của quá trình chuyển hóa sắt lại ít hòa tan, điều này gây
khó khăn cho việc nghiên cứu (Straub và cs, 2001).
Hình 1. Chu trình sắt trong tự nhiên (Ehrlich và Newman, 2008). 1 - Vi sinh vật
trong môi trờng acid; 2 - Vi sinh vật kỵ khí ở môi trờng trung tính (khử nitrate,
quang hợp kỵ khí); 3 - Quá trình hóa học trong môi trờng trung tính với nồng độ O
2

trung tính gần đây đã đợc xác định thuộc vào các phân lớp -, -, - Proteobacteria
(Edwaras và cs, 2003; Emerson và Weiss, 2004; Dhillon và cs, 2005; Rentz và cs,
2007).
1.1.4. Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hóa Fe(II)
Trong những khu vực có ánh sáng, Fe(III) có thể cũng đợc tạo thành thông
qua hoạt tính oxy hóa Fe(II) của vi khuẩn quang hợp có khả năng sử dụng Fe(II) nh
một nguồn cho điện tử để tạo các đơng lợng khử cho quá trình đồng hóa carbon vô
cơ (Weber và cs, 2006 a). Vi khuẩn quang hợp kỵ khí là vi khuẩn oxy hóa Fe(II)
bằng con đờng kỵ khí đợc biết điến đầu tiên (Widdel và cs, 1993). Vi khuẩn này phổ
biến đợc biết đến hiện nay thuộc các chi Chlorobium, Rhodobacter, Thiodictyon,
Rhodovulum, Rhodomicrobium (Ehrenreich và Widdel, 1994; Heising và Schink,
1998; Heising và cs, 1999; Straub và cs, 1999; Kappler và Newman, 2004; Miot và
cs, 2009). Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn quang hợp oxy hóa
Fe(II) không có khả năng sử dụng Fe(II) ở dạng khoáng mà chỉ có thể oxy hóa
Fe(II) ở dạng ion hòa tan (Kappler và Newman, 2004), do đó chúng chỉ đóng vai trò
nhỏ trong quá trình oxy hóa - khử sắt và sự phong hóa sắt trong môi trờng trên cạn.
1.1.5. Vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II)
Gần đây, việc xác định đợc các vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) đã lấp đầy chỗ
trống trong bức tranh tổng thế về chu trình oxy hóa - khử sắt nhờ vi sinh vật (Widdel
và cs, 1993; Straub và cs, 1996). Các bằng chứng gần đây cũng đã chỉ ra rằng vi
khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) có thể đóng vai trò quan trọng trong chu trình oxy hóa -
khử sắt (Senn và Hemond, 2002; Straub và cs, 2004; Weber và cs, 2006 c), trong
chu trình sinh địa hóa đất, trầm tích, khoáng hóa, và quá trình cố định các chất
phóng xạ và kim loại nặng (Chaudhuri và cs, 2001; Weber và cs, 2001; Lack và cs,
2002; Weber và cs, 2006 c). Trong môi trờng không có oxy, quá trình oxy hóa
Fe(II) nhờ vi khuẩn đã đợc chứng minh là thờng đi kèm với quá trình khử
Chuyên ngành Vi sinh vật học
6
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16



NO
3

NH
3
Nitrate hoá
Khử Nitrate
Pseudomonas, Alcaligenes
Bacillus, Agrobacterium

Cố định Nitơ
Azotobacter, Rhizobium
NO
2

N
2
NO
N
2
O
Nitrosomonas
Nitrobacter
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

ammonium thành nitrite: NH
4
+
+ 1,5 O

2
. Các
nghiên cứu về đa dạng và sinh thái cho thấy phổ biến nhất trong các môi trờng đất,
nớc và nớc thải là các loài thuộc chi Pseudomonas (P. fluorescens, P. aeruginosa, P.
denitrificans) và Acaligenes (Shapleigh, 2000).
Trong tự nhiên, vi khuẩn có khả năng sinh trởng bằng cách khử nitrate tơng
đối đa dạng, thuộc nhiều nhóm phân loại khác nhau (Shapleigh, 2000). Nguồn điện
tử cho nhóm vi khuẩn này sử dụng để khử nitrate cũng rất phong phú, bao gồm các
acid hữu cơ, cacbuahydro mạch thẳng hay mạch vòng, kể cả một số chất khó phân
hủy (Shapleigh, 2000). Trong môi trờng nớc ngọt nitrate là chất nhận điện tử quan
trọng thứ hai sau oxy, vì thế nhóm vi khuẩn khử nitrate ở đây cũng đa dạng hơn so
với môi trờng nớc lợ và nớc mặn, nơi có vi khuẩn khử sulfat chiếm u thế do ảnh h-
ởng của nồng độ sulfate (SO
4
2-
) cao từ nớc biển.
1.3. Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate
ở pH trung tính, oxy hóa Fe(II) hòa tan và Fe(II) ở dạng khoáng nhờ vi
khuẩn kỵ khí không phụ thuộc ánh sáng xảy ra đồng thời với quá trình khử nitrate
đã đợc chứng minh trong các môi trờng nớc mặn và nớc ngọt khác nhau, bao gồm cả
đất ruộng, ao, suối, mơng, phá nớc lợ, hồ, đầm lầy, lớp ngập nớc, thủy nhiệt, trầm
tích đáy biển (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998; Chaudhuri và cs, 2001; Ratering
và Schnell, 2001; Hauck và cs, 2001; Senn và Hemond, 2002; Edwards và cs, 2003).
Những môi trờng này chứa quần xã vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate khoảng 10
3
-
5ì10
8
tế bào/g trầm tích tham gia vào chu trình oxy hóa - khử sắt.
Chuyên ngành Vi sinh vật học

+
từ việc khử nitrate (Straub và cs,
1996, 1998; Benz và cs, 1998). Trong tất cả các vi khuẩn đợc biết đến, oxy hóa
Fe(II) luôn đi kèm với khử nitrate thành N
2
(Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998).
Gần đây, Weber và cộng sự (2006 c) mới phát hiện đợc chủng Geobacter sp. có cả
hai khả năng khử Fe(III) và oxy hóa Fe(II) bằng nitrate tạo NH
4
+
là sản phẩm của
quá trình khử.
Vì quá trình oxy hóa Fe(II), khử nitrate không bị giới hạn bởi vùng tiếp xúc
ánh sáng nên có thể có vai trò quan trọng hơn quá trình oxy hóa kỵ khí nhờ vi khuẩn
quang hợp (Straub và cs, 2001). Đáng chú ý là hầu hết các thí nghiệm làm giàu hay
nuôi cấy vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đã tiến hành đều phụ thuộc vào nguồn
carbon hữu cơ (nh Na-acetate) (Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998), tức là điều
điện sinh trởng dị dỡng vô cơ. Phơng pháp MPN đã cho thấy FOM dị dỡng chiếm
0,8% tổng số vi khuẩn khử nitrate và thờng gặp hơn so với FOM tự dỡng (Straub và
cs, 1998). Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tự dỡng mới chỉ đợc biết đến với hai
chủng Ferroglobus placidus, là một vi khuẩn cổ a nhiệt (Hafenbradl và cs, 1996) và
chủng 2002, là vi khuẩn a ấm thuộc phân lớp -Proteobacteria (Weber và cs, 2006
b).
1.4. Cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe(II) và các gen liên quan
Cho đến nay cha có bất cứ công bố nào về cơ chế phân tử của quá trình oxy
hóa Fe(II) ở vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate. Tuy nhiên, quá trình oxy hóa
Fe(II) ở vi khuẩn hiếu khí, a acid Acidithiobacillus ferrooxidans đã đợc nghiên cứu
khá chi tiết.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
9

Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

Hình 4. Mô hình mới nhất hiện nay về cơ chế dẫn truyền điện tử từ Fe(II) đến
O
2
trong quá trình oxy hóa Fe(II) ở A. ferrooxidans (Ehrlich và Newman, 2008).
OM, màng ngoài; PP, khoảng gian màng; PM, màng sinh chất; Cyc1, cytochrome
c
1
; Cyc2, cytochrome c
2
; rc, rusticyanin; bc
1
, phức hợp cytochrome bc
1
; aa
3
,
cytochrome aa
3
; mũi tên chỉ hớng dòng điện tử.
Cho đến năm 2002, Yarzábal và cs đã xác định đợc cytochrome c có khối l-
ợng phân tử lớn (Cyc2) trên màng ngoài của A. ferrooxidans chủng 23270 và chủng
33020 bằng phơng pháp sinh học phân tử (Yarzábal và cs, 2002a, b). Trớc đó gen
mã hóa cho Cyc2 cũng đã đợc chứng minh là gen thuộc operon rus (Appia-Ayme và
cs, 1999). Operon này bao gồm các gen mã hóa cho tất cả các protein liên quan đến
chuỗi dẫn truyền điện tử từ Fe(II) tới O
2
và chúng đợc điều hòa rất nghiên ngặt
(Yarzábal và cs, 2004). Những protein đợc mã hóa từ operon rus sẽ vận chuyển điện

phép. Hàm lợng nitrate trong vùng nớc châu thổ sông Cửu Long, Việt Nam lên đến
80 mg/L (Mai Thanh Truyết, 1997), trong khi hàm lợng cho phép là 45 mg/L
(TCVN 5944 - 1995). Nghiên cứu của Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên cho biết
tình trạng ô nhiễm các kim loại nặng nh sắt và mangan rất đáng báo động, hàm lợng
sắt lên tới 50 mg/L, trong khi hàm lợng tiêu chuẩn cho phép là 1 - 5 mg/L (TCVN
5944 - 1995).
1.5.1. ảnh hởng của nitrate đến sức khỏe con ngời
Hội chứng trẻ da xanh (methemoglobinaemia): Hội chứng
methemoglobinemia đợc hình thành do nhiều nguyên nhân, trong đó bao gồm cả
việc thiếu hụt các enzyme khử methemoglobin (mang tính di truyền), sự khác thờng
về mặt di truyền của hemoglobin (dễ bị oxy hóa), và ảnh hởng của dợc phẩm và hóa
chất có tính oxy hóa bao gồm cả nitrate và nitrite (Avery, 1999). Nitrate hoặc nitrite
Chuyên ngành Vi sinh vật học
12
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

oxy hóa Fe(II) trong hemoglobin thành Fe(III) là nguyên nhân khiến hemoglobin
chuyển thành dạng methemoglobin, ở trạng thái này hồng cầu không thể liên kết và
vận chuyển oxy (Avery, 1999; Lundberg và cs, 2004). Thông thờng, khi
methemoglobin hình thành đợc khoảng 15% lợng hemoglobin lu thông thì bắt đầu
hình thành hội chứng xanh tím (Avery, 1999). Hội chứng này phổ biến ở trẻ dới 6
tháng tuổi bởi vì lợng enzyme khử methemoglobin (reductase NADH-cytochrome
b
5
) của chúng chỉ bằng một nửa của ngời lớn (Lundgerg và cs, 2004). Tác hại của
nitrate đối với sức khỏe con ngời không phải là do bản thân ion nitrate gây ra. Thực
tế là nitrate có độc tính rất thấp nhng khi nồng độ nitrate tăng lên thì nó sẽ chuyển
thành nitrite nhờ xúc tác của enzyme vi khuẩn và chính nitrite là nguyên nhân gây
độc (Lundberg và cs, 2004).
Ung thu dạ dày: Quá trình chuyển hóa giữa nitrate và nitrite có thể hình

năng các cơ quan này (Trần Thị Kiều My và Nguyễn Hà Thanh, 2006).
Tác hại của thừa sắt trong cơ thể hiện nay vẫn còn đang gây nhiều tranh
cãi. Ngời ta cho rằng bộ não là mục tiêu chính của sự thừa sắt, sự tích lũy sắt trong
mô não hoặc gây ra hoặc đóng góp vào việc sinh ra bệnh về thần kinh nh Parkinson
và Alzheimer. Sắt còn đợc coi nh là một chất gây ung th rất mạnh. Và hiện nay ngời
ta đã có các bằng chứng chứng minh thừa sắt gây ra bệnh ung th gan. Sắt d thừa lắng
đọng trong tim và các động mạch có thể gây nên các bệnh về tim cũng nh là phá vỡ
động mạch. Sắt thừa lắng đọng trong lá lách sẽ phá vỡ sự bài tiết insuline và gây ra
bệnh đái tháo đờng nghiên trọng ở ngời lớn (ngời ta tìm thấy những lợp sắt lắng
đọng trong các tế bào tụy ở ngời có bệnh đái đờng tuýp 2) (Moon, 2008).
Để có thể hấp thu đợc, sắt phải chuyển từ dạng ferric (Fe(III)) sang dạng
ferrous (Fe(II)). Pepsin tách sắt khỏi các hợp chất hữu cơ và chuyển thành dạng gắn
với các acid amin hoặc đờng. Acid clohydric khử Fe(III) thành Fe(II) để hấp thu
(Trần Thị Kiều My và Nguyễn Hà Thanh, 2006). Vì vậy nên lợng sắt d thừa trong n-
ớc uống cho dù ở dạng Fe(II) hay Fe(III) đều gây nguy hiểm cho con ngời.
1.6. ý nghĩa của việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền và tiềm năng ứng
dụng của các vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate
Với khả năng hô hấp kỵ khí bằng nitrate, vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate
có thể tham gia vào quá trình loại bỏ nitơ trong các nguồn nớc thải hay nớc sinh
Chuyên ngành Vi sinh vật học
14
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

hoạt có nồng độ nitơ cao. Quá trình này diễn ra khi có mặt các hợp chất hữu cơ làm
nguồn điện tử thích hợp để khử nitrate, ví dụ nh lactate, acetate hay methanol là
những sản phẩm của quá trình phân giải chất hữu cơ cao phân tử. Bên cạnh đó, khả
năng sinh trởng vô cơ sử dụng Fe(II) làm nguồn điện tử để khử nitrate là một u thế
của nhóm vi khuẩn này so với các loài khử nitrate thông thờng. Do tác động của vi
khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate, cùng một lúc ion Fe(II) và nitrate d trong nguồn
nớc có thể đợc loại bỏ. Khả năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn này có ý nghĩa đối

(Bano và Hollibaugh, 2000).
Phơng pháp DGGE dựa trên việc di chuyển của các phân đoạn 16S rDNA đã
đợc khuếch đại trên gel polyacrylamide có chứa chất biến tính. Trong phơng phày
này, các phân đoạn DNA giống nhau về chiều dài nhng khác nhau về trình tự các
cặp bazơ có thể đợc phân tách (Fischer và Lerman, 1979). Trình tự giàu GC (còn gọi
là kẹp GC) có thể đợc gắn vào một trong hai mồi trong phản ứng PCR để ổn định
khả năng biến tính của các phân đoạn trên gel polyacrylamide để có thể xác định đ-
ợc 100% số trình tự có trong mẫu (Myers và cs, 1985; Sheffield và cs, 1989).
DGGE cho phép xác định cả những vi sinh vật không thể phân lập và nuôi cấy đợc
(Davies và cs, 2004).
1.7.2. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)
FISH là một trong số những phơng pháp cho phép xác định nhóm phân loại
của vi khuẩn trong mẫu mà không qua nuôi cấy bằng cách lai với các đầu dò gắn
huỳnh quang đặc hiệu cho rRNA và pháp hiện trên kính hiển vi huỳnh quang. FISH
ứng dụng cho vi khuẩn lần đầu tiên đợc mô tả hai mơi năm về trớc (Giovannoni và
cs, 1988; Delong và cs, 1989; Amann và cs, 1990), và đợc đợc đánh dấu nh một bớc
tiến vợt bậc trong lĩnh vực sinh thái vi sinh vật. Phơng pháp này chủ yếu dựa trên
trình tự của hệ tiểu đơn vị 16S rRNA, là trình tự đã đợc rất quan tâm trong nghiên
cứu hệ thống phân loại của vi sinh vật (Woese và cs, 1990; Ludwig và Schleifer,
1994). Đây là phơng pháp duy nhất cho phép quan sát tính đa dạng di truyền trực
tiếp trong môi trờng qua các tế bào bắt cặp với đầu dò đặc hiệu khác nhau (Amann
và cs, 1995).
1.7.3. ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis)
ARDRA là phơng pháp phân tích các đoạn cắt giới hạn của 16S DNA sau khi
đợc khuếch đại bằng phản ứng PCR. ARDRA đợc sử dụng để phân tích quần xã vi
Chuyên ngành Vi sinh vật học
16
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16

khuẩn trong các môi trờng khác nhau (Moyer và cs, 1994; Martínez-Murcia và cs,

tích thu thập ngoài môi trờng
tự nhiên, đợc đảm bảo kỵ khí
nghiêm ngặt.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất đợc sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật đều là những hóa chất
có tiêu chuẩn chất lợng cao của các hãng cung cấp lớn nh Merck, Sigma. Hoá chất
và một số kit dùng cho phân tích sinh học phân tử do các hãng Bioneer-Hàn Quốc,
Fermentas-Đức, Qiagen-Mỹ, ABI-Mỹ, BioRad-Mỹ cung cấp.
- Hóa chất sử dụng nuôi cấy vi khuẩn: Các chất khoáng (bảng 1), vi lợng (bảng 2),
vitamine (bảng 2), chất cho điện tử (FeSO
4
và MnSO
4
), chất nhận điện tử (NaNO
3
),
khí N
2
và CO
2
.
- Hóa chất sử dụng trong phơng pháp quang phổ xác định hàm lợng sắt II, mangan II
và nitrate: hydroxylamine hydrochloride, formaldehyde, ammonia, phenanthroline,
ammonium acetate, disulfofemic...
- Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm sinh học phân tử: Hóa chất cần thiết để tách
DNA, PCR, tinh sạch sản phẩm PCR, điện di biến tính, giải trình tự.
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
Chuyên ngành Vi sinh vật học
18