LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến
TS.Nguyễn Thị Kiều Anh – phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học
Dược Hà Nội và TS.Phạm Thị Thanh Hà – bộ môn Hóa phân tích-Kiểm
nghiệm trường Đại học Dược Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn, quan tâm giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo ở Phòng đào tạo sau đại
học, Bộ môn Hóa phân tích-Kiểm nghiệm, Phòng thí nghiệm trung tâm
trường Đại học Dược Hà Nội, đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình
học tập và nghiên cứu.
Tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm
Khoa Dược trường Đại học Y Dược Huế đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè,
đồng nghiệp đã động viên, khích lệ tôi rất nhiều để tôi có thêm sự nhiệt tình
và say mê nghiên cứu khoa học.
Hà Nội, tháng 12 năm 2009
Học viên
Đào Thị Cẩm Minh
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chuơng 1
TỔNG QUAN
1.1.TÌNH HÌNH BỆNH LAO THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 3
1.1.1.Tình hình bệnh lao trên thế giới

2.4.2.Thẩm định phương pháp
2.4.3.Định lượng INH trong dịch sinh học
Chương 3
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
3.1.KẾT QUẢ XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TẠO DẪN CHẤT
TRONG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 29
3.1.1.Khảo sát điều kiện sắc ký
3.1.2.Xây dựng qui trình dẫn chất hoá
3.2.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 38
3.2.1.Tính chọn lọc
Tiến hành như mục 2.4.2, kết quả sắc ký đồ của dịch sinh học trắng,
dịch sinh học có thêm INH, và dịch sinh học có thêm INH, PZA,
RMP được trình bày ở các hình 3.5, 3.6, 3.7, 3.8
3.2.2.Khoảng nồng độ tuyến tính
3.2.3.Độ chính xác
3.2.4.Độ đúng
3.2.5.Độ tìm lại
3.2.6.Giới hạn định lượng (LOQ)
3.2.7.Độ ổn định
3.3.ĐỊNH LƯỢNG ISONIAZID TRONG DỊCH SINH HỌC CỦA BỆNH NHÂN LAO
47
3.3.1.Nồng độ INH trong huyết tương bệnh nhân
3.3.2.Nồng độ INH trong dịch màng phổi của bệnh nhân
Chương 4
BÀN LUẬN
4.1.VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ISONIAZID TRONG DỊCH SINH HỌC 53
4.1.1.Về quá trình tạo dẫn chất hóa
4.1.2.Về xây dựng điều kiện sắc ký
4.1.3.Thẩm định phương pháp phân tích
4.2.VỀ ỨNG DỤNG 59

TCA : Acid tricloroacetic
UV : Tử ngoại (Ultra Violet)
WHO : Tổ chức Y tế thế giới
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Tỷ lệ mắc và tử vong do lao trên thế giới
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng INH trong dịch sinh học
Bảng 2.1: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn
Bảng 3.1: Các biến đầu vào và các mức
Bảng 3.2: Các biến đầu ra
Bảng 3.3: Mô hình thiết kế thí nghiệm và kết quả
Bảng 3.4: Các hệ số hồi quy của Y1
Bảng 3.5: Các hệ số hồi quy của Y2
Bảng 3.6: Phân tích phương sai cho Y1
Bảng 3.7: Phân tích phương sai cho Y2
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của INH
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ tìm lại của phương pháp
Bảng 3.12: Kết quả khảo sát giới hạn định lượng
Bảng 3.14: Kết quả nồng độ INH (µg/ml) trong dịch màng phổi bệnh nhân
Bảng 3.15: Kết quả nồng độ INH (µg/ml) trong huyết tương bệnh nhân
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 3.1: Sắc đồ của dịch sinh học trắng (a), dịch sinh học có INH (b), và phổ UV
của pic ứng với INH (c)
Hình 3.2: Sắc đồ mẫu định lượng với nồng độ TCA 20 %
Hình 3.3a: Các đường đồng mức của Rs với nồng độ CA là 1%
Hình 3.3b: Các đường đồng mức của S với nồng độ CA là 1%
Hình 3.4: Các đường đồng mức của diện tích S pic INH (a) và độ phân giải Rs (b)
với nồng độ CA là 1%
Hình 3.5: Sắc đồ mẫu huyết tương trắng (a) và dịch màng phổi trắng (b)

và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng lạc quan của y giới, làm
lãng quên căn bệnh nguy hiểm này. Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại
và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gây
mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển.
Bệnh lao kháng thuốc xuất hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặc
nhiều loại thuốc chống lao, nguyên nhân có thể là do nhiều bệnh nhân không
hợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc điều trị, hay do thầy thuốc kê đơn
không đúng, do không phối hợp đầy đủ các thuốc chống lao, liều lượng thuốc
không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không đúng cách, điều trị không đủ thời gian
… Để đạt được hiệu quả điều trị cần giám sát nồng độ thuốc trong dịch sinh
học để sớm có điều chỉnh kịp thời đạt hiệu quả điều trị. Isoniazid là một trong
những thuốc thiết yếu của phác đồ điều trị lao trong chương trình chống lao
quốc gia (CTCLQG). Đã có nhiều phương pháp định lượng các hoạt chất
trong những dạng thuốc phối hợp (có isoniazid) điều trị lao ở dạng chế phẩm
[6],[7],[9],[10],[17],[19]. Còn trong dịch sinh học, việc định lượng isoniazid
tiến hành chủ yếu ở huyết tương hay nước tiểu của người [11], [23], [26], mà
ít có những phương pháp định lượng isoniazid tại cơ quan tổn thương cụ thể
là phổi, dịch màng phổi. Bên cạnh đó, khi tiến hành định lượng các hoạt chất
ở dạng phối hợp thì isoniazid lại cho kết quả chỉ dạng vết, khó xác định nồng
độ một cách chính xác, nhất là trong dịch màng phổi của bệnh nhân lao sau
1
khi uống thuốc này [11],[16]. Do đó, việc xây dựng phương pháp định lượng
mà giới hạn định lượng INH với độ nhạy cao để có thể xác định được nồng độ
isoniazid trong dịch sinh học của bệnh nhân lao là rất cần thiết.
Xuất phát từ thực tế, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu định
lượng Isoniazid trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo
dẫn chất hóa trước cột ” nhằm :
-Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoniazid trong dịch
sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn chất hóa trước cột.
-Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng nồng độ isoniazid

Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông-Nam Châu Á.
Dưới đây là ước tính tỷ lệ mắc và tử vong do lao ở các khu vực (WHO, 2004).
Bảng 1.1: Tỷ lệ mắc và tử vong do lao trên thế giới
Khu vực
Số BN (nghìn) Tỷ lệ/100 000
Tử vong do lao
(bao gồm cả nhiễm HIV)
Các
thể
Các thể
(%)
AFB
(+)
Các
thể
AFB
(+)
SL
(nghìn)
TL/100000
Châu Phi 2354 (26%) 1000 350 149 556 83
Châu Mỹ 370 (4%) 165 43 19 53 6
Trung Đông 622 (7%) 279 124 55 143 28
Châu Âu 472 (5%) 211 54 24 73 8
Đông nam
Châu Á
2890 (33%) 1294 182 81 625 39
Tây Thái
Bình Dương
2090 (24%) 939 122 55 373 22

Điều mà CTCLQG cần làm là sự đồng tình hỗ trợ của mọi người, mọi
gia đình và mọi đoàn thể trong nước và quốc tế cùng với chính quyền trong
việc thực hiện chiến lược chống lao DOTS điều trị lao có kiểm soát với phác
đồ hóa ngắn ngày cho 100% bệnh nhân lao trong cả nước. Đó là biện pháp
duy nhất có được để ngăn chặn dịch lao trong tình hình hiện nay.
1.1.3.Phác đồ điều trị lao
5
Lao là bệnh nhiễm khuẩn lây truyền có từ lâu đời và tác nhân gây bệnh
chính là trực khuẩn hình que được nhà bác học Robert Kock tìm ra trong đàm
của người bị lao phổi từ năm 1882. Bệnh lao có 2 thể: lao phổi và lao ngoài
phổi. Lao phổi chiếm từ 70% đến 80% trong tổng số lao chung. Lao phổi là
thể lây chủ yếu theo đường hô hấp từ người bệnh sang người lành. Người
bệnh lao khi ho khạc hay hắt hơi làm bắn ra bên ngoài nhiều vi khuẩn lao nằm
trong các hạt đàm nhớt li ti bay lơ lửng trong không khí. Con người sẽ bị
nhiễm lao nếu hít phải không khí có chứa vi khuẩn lao. Lao phổi tìm có vi
khuẩn lao trong đàm soi trực tiếp là nguồn lây lao chính cho cộng đồng. Mỗi
bệnh nhân lao phổi có thể lây cho 20 – 30 người lành trong 2 năm nếu không
được điều trị lành.
Các phác đồ. chính điều trị lao hiện nay được áp dụng ở Việt Nam [5],
[7], [15].
- Lao phổi mới ở người lớn: 2 (Streptomycin, Isoniazid, Pyrazinamid)/
6 (Isoniazid, Ethambutol)
- Lao phổi tái phát, lao phổi mạn tính và thể lao nặng: 2 (Streptomycin ,
Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid, Ethambutol)/ 1 (Rifampicin, Isoniazid,
Pyrazinamid, Ethambutol)/ 5 (Rifampicin, Isoniazid. Ethambutol)
Lao mới là bệnh nhân chưa được điều trị lao bao giờ hoặc đã điều trị
chưa được 1 tháng.
Lao phổi tái trị là những bệnh nhân đã được chẩn đoán mắc lao trước
đây, được điều trị (đủ hoặc chưa đủ thời gian) với kết quả triệu chứng đã hết
hoặc thuyên giảm trong 1 tháng hoặc hơn. Bệnh nhân quay lại với triệu chứng

7
trừ khoảng 75-95% dưới dạng đã chuyển hóa. Một lượng nhỏ thải qua phân.
Thuốc có thể loại khỏi máu bằng thẩm phân thận nhân tạo hay thẩm phân
màng bụng [7].
1.2.1.2.Cơ chế tác dụng
Cơ chế tác dụng của INH vẫn chưa biết chính xác, có thể do thuốc ức
chế tổng hợp acid mycolic và phá vỡ thành tế bào vi khuẩn lao. Nồng độ ức
chế tối thiểu in vitro đối với trực khuẩn lao từ 0,02-0,2 µg/ml [8].
1.2.1.3.Chỉ định, liều lượng, cách dùng
INH được chỉ định phòng và điều trị mọi thể lao trong và ngoài phổi,
sơ nhiễm và tái phát.
Liều tấn công: 5mg/kg/24h dùng hàng ngày.
Liều duy trì: 10mg/kg/lần x 3 lần/tuần hoặc 15mg/kg/24h x 2lần/tuần.
Tốt nhất là uống thuốc trước khi ăn 1h hoặc sau ăn 2h. Có thể uống thuốc
cùng với bữa ăn nếu bị kích ứng đường tiêu hóa [9].
1.2.2.Tính chất hóa lý
1.2.2.1.Công thức hóa học
-Công thức phân tử: C
6
H
7
N
3
O ; M=137,1
-Công thức cấu tạo:
-Tên khoa học: 4-pyridin carboxylic acid hydrazid (hydrazid của acid
8
isonicotinic)
1.2.2.2.Tính chất vật lý
Bột kết tinh màu trắng, không mùi, dễ tan trong nước (1/8), hơi tan

2
↑+H
2
O
 Phản ứng ngưng tụ với aldehyd, ceton tạo hydrazon ít tan trong nước,
có điểm chảy xác định. Phản ứng này được ứng dụng để tạo ra nhiều dẫn chất
của INH.
+ → + H
2
O
1.2.3.Các phương pháp định lượng Isoniazid
a.Đối với nguyên liệu, chế phẩm:
 Phương pháp đo Brom :
Trong môi trường acid với sự có mặt của kali bromid, chuẩn độ chậm
bằng dung dịch kali bromat 0,1N, dùng chỉ thị màu đỏ methyl hoặc
ethoxychrysoidin, hoặc xác định điểm kết thúc bằng đo thế [9].
 Chuẩn độ trong môi truờng khan :
Chuẩn độ bằng acid percloric trong môi trường acid acetic có mặt của
anhydrid acetic, chỉ thị p-naphtholbenzein [7].
 Định lượng bằng phương pháp đo iod :
Oxy hóa INH bằng brom thừa trong môi trường acid, sau đó thêm một
lượng KI dư rồi chuẩn độ iod giải phóng bằng natri thiosulfat với chỉ thị hồ
tinh bột [9].
10
 Đo quang phổ hấp thụ tử ngoại:
Cho isoniazid phản ứng với dung dịch 6-methyl-2-pyridinecarboxaldehyd
0,025 % trong ethanol và đệm KCl/HCl pH 1, để nóng hỗn hợp này trong nước
10 phút sau đó hoà loãng với nước. Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng
328 nm [19].
Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn và thử trong môi trường dung

OSD
(250x4,6mm;5
μm)
1,3
ml/phút
265nm -Trực tiếp
-LOQ=1 μg/ml
16 Dịch sữa gia
súc
Methanol: đệm
acetate (40:60, tt/tt)
Cột Li 100-CN
(250x4,6mm;5
μm)
1,0
ml/phút
330nm -Dẫn chất bằng
cinnamaldehyd
-LOQ=0,1 μg/l
18 Huyết tương
chuột
Isopropanol:nước
(5:95)
Cột LC-CN 1,0
ml/phút
313nm -Dẫn chất
-LOD=0,1μg/ml
22 Huyết tương
người
Ethanol:nước

Sắc ký lỏng hiệu năng cao hay sắc ký lỏng cao áp (HPLC) là kỹ thuật
phân tích dựa trên cơ sở của sự tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột,
nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Pha tĩnh có thể là
chất rắn dưới dạng hạt mịn hoặc chất lỏng được bao trên bề mặt chất mang
rắn đã được liên kết hóa học với một chất hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra
theo cơ chế: hấp phụ, trao đổi ion, phân bố hoặc rây phân tử [1], [2].
Hiện nay, sắc ký phân bố pha đảo được dùng nhiều vì nó cho kết quả
tách tốt đối với nhiều đối tượng phân tích [2], [12].
12
Tùy thuộc vào tính chất các pha mà ta có những phương pháp sắc ký
khác nhau. Trong đề tài này, chúng tôi chỉ đề cập đến sắc ký phân bố pha đảo.
-Sắc ký phân bố pha đảo gồm có: Sắc ký lỏng – lỏng
Sắc ký pha liên kết
Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha tĩnh được gắn hóa học với chất
mang tạo nên dẫn chất Siloxan; nếu pha tĩnh là những nhóm chức không phân
cực (C8, C18, …) dung môi phân cực như: Methanol, Acetonitril thì ta có sắc
ký pha đảo.
Trong sắc ký pha đảo thứ tự rửa giải các chất là : chất phân cực ra
trước, các chất ít phân cực và không phân cực ra sau.
Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký là tổng của các mối tương tác:
-Giữa chất phân tích và pha tĩnh.
-Giữa chất phân tích và pha động.
-Giữa pha tĩnh và pha động
1.3.2.Một số thông số đặc trưng
1.3.2.1.Hệ số dung lượng k’
Quá trình tách trong cột sắc ký là sự tương tác của các chất phân tích
với pha tĩnh (nhồi trong cột) dưới tác động của pha động, do đó bản chất của
quá trình sắc ký là sự phân bố chất tan giữa hai pha. Sự phân bố này được đặc
trưng bằng hệ số dung lượng k’; k’ được xác định bằng tỷ số giữa lượng chất
Chất tan

lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh pic của nó trên sắc
đồ [2].
So sánh thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn
làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó.
1.3.2.3.Số đĩa lý thuyết
Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký
nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như là một lớp pha tĩnh có chiều
cao là H, lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách mà
trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình
14
của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động [1], [2], [12].
Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau:
2
R
W
t
16N






=
hoặc
2
2/1
R
W
t

−
=
hoặc
)B(2/1)A(2/1
A,RB,R
S
WW
)tt(18,1
R
+
−
=
Trong đó:
t
R,A
, t
R,B
: thời gian lưu của 2 pic liền kề của 2 chất tan A và B
W
A
,W
B
: độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B
W
1/2(A)
, W
1/2(B)
: độ rộng đáy pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A và B
Trong thực tế nếu các pic cân đối tuân theo phân bố chuẩn (Gauss) thì
độ phân giải để 2 pic có độ lớn bằng nhau tối thiểu là 1,0. Trong phép định

Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc các chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn.
Thiết lập sự tương quan giữa diện tích hoặc chiều cao của pic với nồng
độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán
nồng độ của các chất cần xác định.
1.4.VÀI NÉT VỀ TỐI ƯU HÓA PHƯƠNG PHÁP
1.4.1.Một số khái niệm
16
1.4.1.1.Biến đầu vào và biến đầu ra
 Biến đầu ra còn gọi là biến phụ thuộc hay đáp ứng: Là kết quả của thí
nghiệm mà người làm thí nghiệm thấy cần phải đo đạc và đánh giá.
 Biến đầu vào còn gọi là biến độc lập hay yếu tố: Là những biến mà
người làm thí nghiệm có thể thay đổi giá trị của nó khi tiến hành thí
nghiệm và sự thay đổi này có thể kéo theo sự thay đổi giá trị của biến
đầu ra [13].
1.4.1.2.Tối ưu hoá
Tối ưu hoá một công thức hay một quy trình là việc tìm công thức,
thông số (hay điều kiện tiến hành) của quy trình để sản phẩm làm ra đạt chất
lượng tốt nhất trong phạm vi có thể [13].
Để tối ưu hoá phải mô tả được mối quan hệ giữa biến đầu ra và biến đầu
vào. Có hai cách chính để mô tả quan hệ giữa biến đầu ra và biến đầu vào:
- Dùng mô hình (phương trình) toán học: Đây là cách mô tả đơn giản
và dễ hiểu nhất. Phương trình thường có dạng đa thức bậc nhỏ hơn hoặc bằng
2 và được gọi là phương trình hồi qui.
- Dùng mạng thần kinh nhân tạo (Artificial Neural Network – ANN)
1.4.1.3.Thiết kế thí nghiệm
Thiết kế thí nghiệm là phương pháp lập kế hoạch và tiến hành thực
nghiệm để thu nhận được thông tin tối đa từ tập hợp các dữ liệu thí nghiệm
trong sự có mặt của nhiều yếu tố có thể làm biến đổi kết quả thí nghiệm với
số thí nghiệm tối thiểu.
1.4.1.4.Trình tự thiết kế thí nghiệm về tối ưu hoá