TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
DIỆP THỊ DIỆU
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR GENOTYPING (ORF75)
TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG
TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN
2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy – Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học
Cần Thơ đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý
báu trong suốt thời gian em học tập tại trường.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa - Bộ môn Sinh học và
Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản – trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp
đỡ, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để em có cơ hội
học tập và nắm bắt thêm các phương pháp nghiên cứu khoa học.
Chân thành cảm ơn các anh, chị ở bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản đã nhiệt tình
hỗ trợ, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Xin cám ơn các bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã động viên, giúp đỡ, và trao
đổi kiến thức trong suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp tại Khoa Thủy
Sản
Xin chân thành cảm ơn và chúc Quý thầy cô và các anh, chị, bạn bè lời chúc sức
khỏe và thành đạt.
i
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
TÓM TẮT
Bệnh do tác nhân là virus gây ra trên tôm đang là một vấn đề nan giải cho nuôi
trồng thủy sản Việt Nam và thế giới. Trong đó, bệnh đốm trắng do White spot
syndrome virus gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi.
2.3. Sơ lược về bệnh đốm trắng 8
2.3.1 Đặc điểm cấu tạo của WSSV 9
2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý 10
2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm 10
2.3.4 Phương thức lây nhiễm 11
2.3.5 . Một số phương pháp phát hiện WSSV 12
2.3.6 Một số kết quả nghiên cứu dịch tể về bệnh đốm trắng 12
2.4. Kỹ thuật PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 14
2.4.1 Nguyên tắc phản ứng PCR 14
2.4. 2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 15
2.4.3 Ứng dụng của PCR 16
iii
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 18
3.1.1 Địa điểm 18
3.1.2 Thời gian thực hiện 18
3.2 Vật liệu nghiên cứu 18
3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 18
3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm 18
3.3 Phương pháp nghiên cứu 19
3.3.1 Qui trình phát hiện WSSV 19
3.3.2 Qui trình PCR genotyping (ORF75) 20
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 22
4.1. Ứng dụng qui trình PCR genotyping (ORF75) 22
4.2 Chu kỳ nhiệt 23
4.2.1 Chu kỳ phản ứng 23
4.2.2 Nhiệt độ gắn mồi 24
4.3 Hàm lượng ADN khuôn 25
4.4. Nồng độ mồi 25
v
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1
Diện tích nuôi nước lợ qua các năm 5
Hình 2.2 Sơ đồ của phản ứng PCR 16
Hình 4.1: Kết quả 3 mẫu chạy với qui trình PCR genotyping (ORF75 22
Hình 4.2: Kết quả 10 mẫu chạy với qui trình PCR genotyping (ORF 75) 23
Hình 4.3: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nhiệt độ gắn mồi
khác nhau 24
Hình 4.4: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ mồi 28
Hình 4.5: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ MgCl2 27
Hình 4.6: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ taq ADN
polymerase 28
Hình 4.7: kết quả ba mẫu có cường độ nhiễm khác nhau 29
Hình 4.8: Kết quả ứng dụng 8 mẫu nhiễm WSSV thu ở Cà Mau 31
vi
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
Việt Nam là một nước có điều kiện tự nhiên rất thuận lợi cho việc phát triển thủy
sản. Ngành thuỷ sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của quốc gia.
Trong những năm gần đây phong trào nuôi tôm ở Việt Nam đã đạt những thành
tựu khả quan. Tuy nhiên, song song với việc tăng diện tích nuôi, tăng sản lượng,
tăng mức độ thâm canh thì bệnh dịch thủy sản là một mối nguy lớn đối với nghề
nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là bệnh do virus gây ra đã làm sản lượng tôm giảm
một cách đáng kể.
Với khả năng lan truyền bệnh và gây chết tôm hàng loạt, bệnh virus đã gây thiệt
hại lớn và ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế của nhiều quốc gia có nghề nuôi
tôm phát triển. Đặc biệt là bệnh đốm trắng (White spot disease-WSD), bệnh đầu
2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới
Hiện nay, nghề nuôi tôm biển đã và đang giữ vai trò quan trọng trong nền kinh tế
của nhiều nước trên thế giới. Từ những năm 1980 với sự phát triển mạnh mẽ của
nghề nuôi tôm biển cả về qui mô và mức độ thâm canh đã làm cho sản lượng tôm
tăng vọt. Trong giai đoạn 2000-2003, sản lượng nuôi trồng thủy sản của châu Á
hiện chiếm tới 90% về sản lượng và 80% về giá trị nuôi trồng thủy sản của thế
giới.
Theo thống kê của FAO (2004), hàng năm tỉ lệ tăng trung bình của nuôi trồng
thủy sản tính từ năm 1970 đến năm 2002 là 8,9 %. Sản lượng nuôi trồng thủy sản
thế giới năm 2002 đạt 51,4 triệu tấn. Trong đó sản lượng tôm đạt khoảng 1,29
triệu tấn (trích dẫn bởi Phạm Minh Đức, 2004). Các loài tôm được nuôi nhiều
nhất là tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ Trung Quốc (Penaeus chinensis) và
tôm chân trắng (Penaeus vannamei). Riêng 3 loài tôm này chiếm trên 86% sản
lượng tôm nuôi của thế giới. Tôm sú hiện nay được nuôi ở khắp nơi trên thế giới,
đặc biệt là ở khu vực Châu Á Thái Bình Dương (chiếm 72%) và Mỹ La Tinh
(chiếm 28%). Năm 2003, hai loài tôm sú và tôm thẻ chân trắng chiếm tới 77%
tổng sản lượng tôm nuôi (thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản, sô 4/2003)
2.1.2 Tình hình dịch bệnh ở trên thế giới
Do việc gia tăng hoạt động nuôi trồng thủy sản đã dẫn tới sự bùng nổ dịch bệnh,
bệnh do vi khuẩn và virus trên tôm, gây tổn thất lớn về kinh tế trong ngành thủy
sản. Bệnh trên tôm, nhất là bệnh do virus luôn là nỗi lo của người nuôi trồng và là
mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học. Mặc dù virus gây bệnh trên tôm thì
không có ảnh hưởng gì đến sức khỏe con người nhưng nó gây tổn thất lớn cho
người nuôi tôm.
Trong những năm 1980 Đài Loan dẫn đầu thế giới về sản lượng tôm. Nhưng đến
1988 dịch bệnh xảy ra đã làm sụp đổ nghề nuôi tôm của nước này. Còn Indonesia
là một nước có nghề nuôi tôm xuất hiện lâu đời nhất ở Châu Á và là một trong
những nước dẫn đầu về sản lượng tôm nuôi trong vùng. Tốc độ phát triển của
3
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
600.0
500.0
400.0
300.0
200.0
100.0
0.0
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007
Năm
Hình 2.1: Diện tích nuôi nước lợ qua các năm
Trong năm 2007, diện tích nuôi tôm nước lợ chiếm 62% tổng diện tích mặt nước
nuôi trồng thủy sản của cả nước, với sản lượng là 386,6 nghìn tấn, chiếm 19%
tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản cả nước. Theo số liệu của tổng cục thống kê
cho thấy ở diện tích và sản lượng tôm nuôi chủ yếu tập trung ở đồng bằng sông
Cửu Long (ĐBSCL). Trong năm 2007 diện tích nuôi tôm của ĐBSCL chiếm 71%
tổng diện tích nuôi tôm của cả nước, với sản lượng là 315.435 tấn, chiếm 82%
tổng sản lượng tôm nuôi của cả nước. Các tỉnh có diện tích nuôi tôm nhiều nhất là
các tỉnh thuộc ĐBSCL, gồm Cà Mau (279,2 nghìn ha), Bạc Liêu (123,8 nghìn
ha), Kiên Giang (103,5 nghìn ha), Sóc Trăng (64,3 nghìn ha), Trà Vinh (48,3
nghìn ha). Song song với việc mở rộng diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng tăng
mạnh từ 32,7 nghìn tấn (1990) lên đến 386,6 nghìn tấn (2007). Năm 2003 sản
lượng tôm của Việt Nam đứng hàng thứ 3 trên thế giới. Các loài tôm nuôi chính ở
Việt Nam gồm tôm sú (Penaeus monodon), tôm he mùa (Penaeus merguiensis),
tôm nương (Penaeus orientalis), tôm đất/rảo (Metapenaeus ensis), trong đó tôm
sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất (thông tin chuyên đề Bộ
Thủy Sản số 2/2005).
Theo thông tin do Bộ Thủy sản (2008) đưa ra tại hội nghị tổng kết công tác nuôi
trồng thủy sản giai đoạn 2001 – 2005 là: so với năm 1999, sản lượng nuôi trồng
thủy sản năm 2005 đã tăng gấp 3 lần (đạt 1,437 triệu tấn); diện tích nuôi trồng
tăng 0,83 lần (đạt 959.945 ha); sản lượng tôm sú giống sản xuất trong nước tăng
(Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus -IHHNV), virus gây
còi (Monodon baculovirus- MBV), virus gây đầu vàng (Yellow head virus -
YHV ), …Trong đó, WSSV gây chết tôm hàng loạt, tác hại lớn đến năng suất, sản
lượng tôm của khu vực (Nguyễn Văn Hảo, 2003). Các tỉnh ở Bắc Trung Bộ
(2004) như Thanh Hóa có hơn 40% diện tích nuôi tôm bị bệnh; Nghệ An có 9,1-
47,8% diện tích nuôi tôm bị bệnh đốm trắng; 25,6 - 30,4% bị bệnh MBV; 25-
54,5% bị bệnh đầu vàng. Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh, có 67 ha
6
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
bị bệnh đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi bị chết. Trong năm 2004 các tỉnh
miền Trung và Nam Trung Bộ thì Ninh Thuận là tỉnh có có tỉ lệ diện tích nuôi
tôm bị bệnh cao nhất (52,4%). Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm trắng ở tôm nuôi tại khu vực
này tuy có giảm nhưng bệnh phân trắng, teo gan lại xảy ra hầu hết ở các vùng
nuôi trọng điểm như Ninh Hải, Phan Rang, Ninh Phước có những nơi lên tới 90-
95% tôm bị nhiễm bệnh, đặc biệt là ở những vùng nuôi trên cát. (Quang, 2007).
Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu NTTS II trong năm 2004 tại các
tỉnh Nam Bộ - khu vực nuôi tôm lớn nhất của cả nước, tỉ lệ nhiễm bệnh virus đốm
trắng ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%, còn bệnh MBV là 50%. Bệnh virus
đốm trắng gây chết tôm hàng loạt, tác hại lớn đến năng suất, sản lượng tôm của
khu vực. Theo ước tính của Bộ Thủy sản, thất thoát do bệnh virus gây ra cho tôm
sú vào khoảng 30% – 50% sản lượng thu hoạch (Hà Anh, 2007).
Do tác động của dịch bệnh đến năng suất nuôi, Bộ Thủy sản đã có những nỗ lực
lớn và phối hợp với chính quyền địa phương và các trường đại học, các viện
nghiên cứu trong và ngoài ngành thủy sản để phòng ngừa và dập tắt dịch bệnh.
Bên cạnh đó, để góp phần giảm thiểu sự lan truyền dịch bệnh thông qua việc xuất
nhập động vật thủy sản tài liệu “hướng dẫn kỹ thuật về quản lý thú y thủy sản đối
với việc vận chuyển có trách nhiệm các động vật thủy sinh của khu vực châu Á”
đã được xây dựng, nhằm làm giảm thiểu nguy cơ lan truyền mầm bệnh và lây lan
bệnh giữa các nước trong cùng khu vực.
Riêng bệnh đốm trắng, để phòng bệnh hiệu qủa cần phải áp dụng các phương
trại nuôi tôm ở Nam Mỹ. Cuối năm 1999 bệnh đốm trắng xuất hiện ở Ecuador
(van Hulten ,2001). Đến năm 2002, bệnh đốm trắng được báo cáo là phát hiện
trên các loài giáp xác ngoài tự nhiên ở châu Âu (Pháp) và vùng Trung Đông
(Iran) (Rosebery, 2002 trích dẫn bởi Marks et al., 2005). WSSV xuất hiện ở nhiều
vùng khác nhau và với nhiều tên gọi khác nhau như hypodermal and
haematopoietic necrosis baculovirus (HHNBV) (Durand , 1997), third Penaeus
monodon non-occluded baculovirus (PmNOB III) (Wang , 1995), rod-
shapednuclear virus of penaeus japonicus (RV-PJ) (Inouye et al, 1996), penaeid
rod-shaped ADN virus (Venegas et al, 2000), systemic ectodermal and
mesodermal baculovirus (SEMBV) (Wongteerasupaya et al 1995) hoặc white
spot baculovirus (WSBV) (Lightner, 1996). Cho đến năm 2002 Hội nghị quốc tế
phân loại virus lần thứ 12 (International committee on Taxonomy of viruses -
ICTV) tại Paris mới thống nhất, virus gây Hội chứng đốm trắng thuộc giống
Whispovirus – họ Nimaviridae, với tên gọi chung là White spot syndrome virus
(trích dẫn bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2004).
8
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
Bảng 2.1 : Quá trình bộc phát bệnh đốm trắng ở châu Á và châu Mỹ (Escobedo-
Bonilla C. M. et al., 2008)
Thời gian
bệnh được
phát hiện
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
Bondad-Reantaso 2001
Rosenberry 2001
Magbanua , 2 000; Bondad-
Reantaso et al. 2001; Hossain et
al. 2001; Wu et al. 2001
Bondad-Reantaso et al, 2001
Dieu et al. 2004; Marks 2005
APHIS-USDA 2005
2.3.1 Đặc điểm cấu tạo của WSSV
WSSV có dạng hình trứng, có đuôi, acid nhân là ADN 2 mạch, không có thể ẩn,
chỉ có thể vùi trong nhân của tế bào mang, biểu bì ruột, dạ dày và tế bào biểu bì
dưới vỏ, cơ quan lympho (trích dẫn bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2004). Trong hệ gen
của WSSV có A và T chiếm 59% (Escobedo-Bonilla et al., 2008), WSSV có kích
9
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
thước khá lớn đường kính khoảng 65-70 nm và dài 300 -350 nm (van Hulten el
al.; 2001).
WSSV là một trong những virus có hệ gen lớn nhất được phát hiện (khoảng
300kb). Kích cỡ hệ gen của WSSV khác nhau tùy theo từng vùng khác nhau,
virus được phân lập ở Thái Lan (WSSV- TH) là 292.967 bp (van Hulten et al.,
2001). Còn hệ gen của WSSV được phân lập từ Đài Loan (WSSV-TW) kích
thước là 307.287 bp, hệ gen của WSSV được phân lập từ Trung Quốc (WSSV-
CN) là 305.107 bp (Marks et al, 2005).
Virus có ít nhất 5 lớp protein VP28, VP26, VP24, VP19, VP15 với trọng lượng
phân tử tương ứng là 28, 26, 24, 19, 15 kDa (Escobedo-Bonilla , 2008). VP28 và
VP19 cấu tạo nên màng bao, VP26, VP24, VP15 cấu tạo nên nucleocapsid (van
Hulten et al., 2000 trích dẫn bởi Marks et al., 2005).
Hệ gen của WSSV có chứa khoảng 531 đến 684 ORF (open reading frames),
trong đó có từ 181- 184 ORF có chức năng mã hóa protein có kích thước từ 51
đến 6077 acid amin. Trong đó vùng ORF75, ORF94 và ORF125 có thể được sử
giai đoạn bố mẹ. Tuy nhiên bệnh thường gặp nhất là ở giai đoạn hậu ấu trùng, tiền
trưởng thành và trưởng thành. Và tỉ lệ chết cao nhất là khi tôm nuôi 1-2 tháng.
Bệnh thường xuất hiện khi tôm bị sốc (chẳng hạn như khi nồng độ muối thay đổi
đột ngột hoặc nhiệt độ nước xuống thấp dưới 300C thì bệnh sẽ bệnh bộc phát
nhanh chóng) (Jiravanichpaisal , 2004)
2.3.4 Phương thức lây nhiễm
WSSV có thể lây theo chiều dọc và chiều ngang. Lây nhiễm theo chiều ngang chủ
yếu là do ăn thịt lẫn nhau (tôm khỏe ăn thịt tôm bệnh, hoặc ăn các thức ăn bị
nhiễm WSSV), hoặc lây nhiễm theo nguồn nước (Chou et al., 1998).
Theo Bùi Quang Tề (2006) bệnh đốm trắng lây truyền theo phương ngang là chủ
yếu. Virus này chủ yếu lây từ các giáp xác khác (tôm cua, chân chèo) nhiễm bệnh
đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc ngay bên trong ao nuôi tôm. Những
con tôm khỏe ăn những con tôm bị bệnh đốm trắng chết bị làm cho bệnh lây lan
càng nhanh hơn. Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bệnh đốm trắng từ ao
khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẫu thừa vào ao nuôi. Theo ông bệnh
đốm trắng không có khả năng lây truyền qua theo phương thẳng đứng vì trứng bị
bệnh đốm trắng thì không thể thành thục được. Nhưng trong quá trình đẻ trứng
tôm bố mẹ thải ra các virus đốm trắng từ trong buồng trứng, do đó ấu trùng tôm
dể dàng bị nhiễm virus ngay từ giai đoạn sớm. Theo Lo (1997) thì WSSV ngoài
11
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
lây truyền theo phương ngang thì nó cũng có lây từ mẹ sang con nhưng những
virion của WSSV có hiện diện bên trong trứng hay không thì chưa xác định được.
2.3.5 . Một số phương pháp phát hiện WSSV
Chẩn đoán là việc xác định căn nguyên của bệnh thông qua các triệu chứng của
bệnh (bệnh lý học lâm sàng). Kỹ thuật được sử dụng để chẩn đoán bệnh rất đa
dạng và phong phú, từ quan sát đơn giản cho đến các thiết bị hiện đại dựa trên cơ
sở kỹ thuật sinh học phân tử. Hiện nay có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh do
WSSV gây ra như:
– Dự chẩn: dựa vào dấu hiệu bên ngoài, làm tiêu bản ướt (wet-mounts).
xác định số lần lặp lại của trình tự lặp lại thuộc ORF94. Nghiên cứu đã phát hiện
như sau: trình tự lặp lại thuộc ORF94 có số lần lặp lại nằm trong khoảng 6 đến 20,
trong đó các mẫu có 8 vùng lặp lại chiếm đa số (32%).
Ở Việt Nam vào năm 2004, Bui Thi Minh Dieu et al cũng nghiên cứu về vùng lặp
lại thuộc ORF94 (6 ao ở miền Trung, 2 ao ở miền Nam). Kết quả được ghi nhận
như sau: số vùng lặp lại thuộc ORF94 của tôm bị bệnh đốm trắng ở Việt Nam
nằm trong khoảng 7 đến 17 vùng. Tiếp theo, năm 2006 Lê Vân Hải Yến đã khảo
sát vùng lặp lại thuộc ORF94 ở 2 tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng. Kết quả nghiên cứu
đã xác định ở Trà Vinh số vùng lặp lại thuộc ORF94 chỉ có 3 nhóm là: 5, 8, 9 còn
ở Sóc Trăng thì có số vùng lặp lại thuộc ORF94 là 5, 7, 8, 12. Trong đó các mẫu
có 8 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất (50% ở Sóc Trăng và 57,1% ở Trà Vinh).
Kế tiếp là nhóm tác giả Trần Thị Tuyết Hoa đã khảo sát 169 mẫu tôm bệnh đốm
trắng thu từ 19 ao ở Cà Mau, Bạc Liêu đã ghi nhận: ở ao nuôi tôm Bạc Liêu số
trình tự lặp lại thuộc ORF94 trên bộ gen của WSSV là từ 4 đến 16 vùng; trong đó
kiểu gen WSSV với 5 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất (48.8%) (Trần Thị Tuyết
Hoa và ctv, 2008). Vào năm 2008, Lý Ngọc Hà cũng khảo sát sự biến đổi của
trình tự lặp lại thuộc ORF94 của WSSV trên tôm tại Bạc Liêu và được ghi nhận
là số vùng lặp lại thuộc ORF94 gồm 6 nhóm là: 4, 6, 7, 8, 9, 12. Trong đó, kiểu
gen WSSV với 7 vùng lặp lại thuộc ORF94 chiếm tỉ lệ cao nhất (34,48%). Đặc
biệt là có sự nhiễm đa dòng WSSV trong cùng một ao, và kiểu gen WSSV đang
tồn tại ở Bạc Liêu là rất đa dạng. Còn ở Cà Mau có 3 nhóm vùng lặp lại thuộc
ORF94 trên bộ gen WSSV, từ 5 đến 9 vùng lặp lại (Trần Thị Tuyết Hoa và ctv,
2008).
Ở Ấn Độ, vùng lặp lại thuộc ORF94 có 13 kiểu gen được tìm thấy với số lần lặp
lại từ 2 đến 16, trong đó số lần lặp lại 7 lần là phổ biến nhất chiếm 11,3%, trong
những mẫu phân tích không có mẫu nào có số lần lặp lại là 11, 15 (Pradeep B,
2007). Vì vậy có thể nói rằng số vùng lặp lại thuộc ORF94 trên bộ gen WSSV ở
13
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
các thời điểm thu mẫu và ở các khu vực địa lí khác nhau thì khác nhau (Trần Thị
chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước, mỗi bước kéo dài
khoảng vài chục giây đến vài phút, trình tự như sau :
14
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
Bước 1: Biến tính (denaturation) nhiệt độ được nâng lên khoảng 940C để làm biến
tính ADN từ dạng sợi đôi (dsADN) thành sợi đơn (ssADN).
Bước 2: Bắt cặp (anealing) trong bước này nhiệt độ trong buồng PCR hạ xuống
nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi, các đoạn mồi (primer) bắt cặp
theo nguyên tắc bổ sung vào hai đầu của chuỗi nucleic acid đích, đây là giai đoạn
quyết định nên tính đặc hiệu của sản phẩm PCR.
Bước 3: Kéo dài (extension) trong giai đoạn này nhiệt độ được nâng lên khoảng
720C . Vì taq popymerase hoạt động tốt ở khoảng nhiệt độ là 70-720C. Ở khoảng
nhiệt độ này, hoạt động đặc biệt của taq popymerase cao khoảng 150
nucleotide/giây/enzime (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Sự tổng hợp
này cần phải có sự hiện diện các deoxy nucleoside triphosphate (dNTPs).
Như vậy từ một số lượng N ADN đích ban đầu, sau n chu kỳ nhiệt, thử nghiệm
PCR đã tổng hợp được N.2n bản sao. Với một số lượng bản sao, hay còn gọi là
sản phẩm PCR (PCR product), chúng ta dễ dàng được phát hiện bằng phương
pháp điện di (Nguyễn Viết Khuê, 2006)
2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
ADN mạch khuôn: Theo Khuất Hữu Thanh (2003), trong kỹ thuật PCR khuôn
ADN có vai trò rất quan trọng, nó ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả của phản ứng
PCR. Phản ứng PCR tối ưu khi các đoạn mạch khuôn hoàn toàn tinh sạch, nhưng
khi các đoạn mạch khuôn không sạch có lẩn các protein thì hiệu quả sẽ giảm, nó
sẽ giảm theo tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của mạch khuôn ADN. Hàm lượng ADN
khuôn nằm trong khoảng 100 ng - 1 µg (Newton và Graham,1995 trích dẫn bởi
Trần Thị Mỹ Duyên, 2006).
Enzyme: Lượng enzyme cần thiết là phụ thuộc vào lượng ADN mẫu và kích
thước phản ứng PCR.
Nồng độ Mg2+: Nồng độ ion Mg2+ tối ưu phụ thuộc vào loại ADN polymerase,
học phân tử, vi sinh, kiểm nghiệm, chẩn đoán…để phát hiện mầm bệnh, vi sinh
vật, virus, tạo đột biến gen và xác định các mối quan hệ họ hàng về di truyền của
các loài động vật và thực vật….Trong thủy sản PCR đã được áp dụng để chẩn
đoán bệnh, trong đó bao gồm: bệnh tôm: MBV, WSSV, YHV, TSV… (Viện
nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1, 2006).
16
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
3.1.1 Địa điểm: phòng thí nghiệm của bộ môn Sinh Học và bệnh Thủy Sản, khoa
Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.2 Thời gian thực hiện: 12/2008 – 5/2009.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm
Mẫu tôm sú (31 mẫu) được thu từ các ao nuôi quãng canh ở Cà Mau, kích cỡ
trung bình từ 15-25 g/con.
3.2.2 Hóa chất thí nghiệm
– Dung dịch DTAB, CTAB, chloroform, cồn tuyệt đối, nước cất tiệt trùng…
– PCR buffer 5X, dNTPs 25 mM, MgCl2 10mM, mồi ORF75-flank Forward,
ORF75-flank Reverse, taq ADN polymerase 5U/∝l (Promega).
– Agarose, TAE 1X, ethidium bromide, dung dịch nạp mẫu, thang ADN (100bp
plus- Fermentas, 1kb plus- Invitrogen )
3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm
– Dụng cụ chiết tách: que nghiền, đầu col (xanh, vàng), pipet (1000∝l, 200∝l),
ống eppendorf, máy vortex, máy ly tâm, máy ủ, tủ hút…
– Dụng cụ khuếch đại: đầu col (xanh, vàng), pipet, ống eppendorf, tủ hút, máy
ly tâm, máy vortex, máy PCR…
–
Dụng cụ điện di: đầu col vàng, pipet, lò vi sóng, bồn điện di, máy chụp hình
- IQzyme DNA Polymerase 2U/μl
7,5μl
0,5μl
14μl
1μ
18
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
Copyright: Tài liệu đại học ©