1
Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nuôi trồng thủy sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể trong
thị phần xuất khẩu của một số quốc gia trên thế giới đặc biệt các nước Châu Á như
Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan,Việt Nam, In-đô-nê-xi-a, Ấn Độ. Hiện nay để tăng
sản lượng nuôi tôm, việc áp dụng kỹ thuật tiên tiến như nuôi thâm canh năng suất cao
và tăng diện tích nuôi đã có nhiều tác động đến môi trường sinh thái các vùng nuôi.
Vấn đề ô nhiễm môi trường, sự bùng phát dịch bệnh cũng thường xuyên diễn ra. Trong
đó bệnh đốm trắng chiếm tỷ lệ rất cao. Bệnh này đã gây thiệt hại không nhỏ cho nghề
nuôi tôm sú từ những năm 1993 - 1994 và đã tác động mạnh đến nghề nuôi tôm công
nghiệp của thế giới.
Bệnh đốm trắng gây tác hại rất nghiêm trọng trên tôm sú. Đặc trưng của bệnh là
gây nên tỷ lệ chết khá cao và có thể gây chết hàng loạt cho tôm sú nuôi trong thời gian
ngắn trên các ao nuôi bị nhiễm bệnh. Sự lan rộng của dịch bệnh đốm trắng đã làm sản
lượng tôm nuôi ở Đài Loan từ 95.000 tấn vào năm 1987 giảm xuống chỉ còn 30.000
tấn vào năm 1988 (Liao và ctv., 1992; trích bởi Thuy Thi Ngoc Phan, 2001); ở Việt
Nam sản lượng tôm nuôi từ 50.000 tấn vào năm 1995 giảm xuống còn 30.000 tấn năm
1997 (World Shrimp Farming, 1997; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung, 2000). Hiện nay,
việc nghiên cứu để tìm phương pháp điều trị bệnh này vẫn còn nhiều khó khăn và chưa
có hiệu quả rõ ràng. Phương pháp để hạn chế thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra vẫn là
các biện pháp phòng bệnh trong quá trình nuôi. Trong đó, việc chẩn đoán bệnh đốm
trắng ở giai đoạn tôm giống trước khi thả nuôi và việc chẩn đoán bệnh kịp thời trong
giai đoạn nuôi để có biện pháp xử lý thích hợp là một điều vô cùng cần thiết.
Kỹ thuật PCR từ lâu đã được xem là cách tiếp cận hứa hẹn nhất đối với việc phát
hiện mầm bệnh. Trong những năm qua, kỹ thuật PCR đã phát triển không ngừng thông
qua những cải tiến mới về nguyên lý, thiết bị và hóa chất. Phương pháp Real - time
PCR là một trong những cải tiến mới nhất của kỹ thuật PCR.
Phương pháp Real - time PCR rút ngắn thời gian phân tích kết quả. Khả năng định
lượng trong kỹ thuật Real - time PCR đảm bảo giảm thiểu xác suất dương tính giả đối

- Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú ở các giai đoạn
nuôi qua các mẫu thu từ thực tế.
- Theo dõi, ghi nhận được tình trạng thu hoạch của các ao thả nuôi tôm đã thu mẫu
để xét nghiệm WSSV.
3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu khái quát về tôm sú (Penaeus monodon)
Tôm sú là loài có kích thước lớn nhất của họ tôm he (Penaeidae). Kích thước lớn
nhất có thể đạt đến 290 – 305 mm (200 – 250 gram), trung bình đạt từ 190 – 195 mm,
nặng 150 gram. Chúng ưa sống ở những nơi có đáy bùn cát, độ trong, độ mặn cao và
ổn định. Tuy nhiên, tôm sú có khả năng thích ứng với độ mặn rộng ngay trong thời kỳ
trưởng thành, vì vậy rất thuận lợi cho nghề nuôi tôm trong các đầm mặn, lợ ven biển.
Mùa vụ sinh sản từ tháng 11 - 4 năm sau (Bộ Thủy Sản, 1996).
2.1.1. Phân loại
Theo Phạm Văn Tình (2001), tôm sú được định loại như sau:
Ngành: Arthropoda - Ngành chân khớp
Lớp: Crustacea - Lớp giáp xác
Bộ: Decapoda - Bộ mười chân
Họ chung: Penaeidae
Họ: Penaeidae - Họ tôm he
Giống: Penaeus
Loài: Penaeus monodon
Tên địa phương: tôm sú, tôm cỏ, tôm he, tôm giang (Trần Minh Anh, 1989).
Tiếng Anh: Black tiger shrimp, Tiger prawn, Giant tiger prawn, Grass shrimp,
Tumbo prawn (Nguyễn Văn Chung, 2000).
2.1.2. Vùng phân bố
Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ Ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài

sẽ nở thành ấu trùng (Nauplius). Ấu trùng phát triển
qua các giai đoạn sau:
- Nauplius 6 giai đoạn: 36 – 51 giờ
- Protozoea 3 giai đoạn: 105 – 120 giờ
- Mysis 3 giai đoạn: 72 giờ
Sau đó chuyển thành Postlarvae, Juvenile, Adult (giai đoạn trưởng thành).
Tôm sú đẻ quanh năm, nhưng tập trung vào hai thời kỳ chính: tháng 3 – 4 và tháng
7 – 10. Tuổi thọ tôm sú con đực khoảng 1,5 năm; con cái khoảng 2 năm (Phạm Văn
Tình, 2001). Hình 2.1 Vòng đời tôm sú Penaeus monodon

(Nguồn: FAO và Multimedia Asia Co., Ltd., 1999)


Theo Bùi Quang Tề (2003), từ năm 1993 – 1994 đến nay bệnh đốm trắng trên tôm
thường xuất hiện ở các vùng nuôi tôm ven biển từ nuôi quảng canh đến nuôi thâm
canh, bệnh đã gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm.

6
Ở các tỉnh ven biển phía Nam từ năm 1993 – 1994, hiện tượng tôm chết hàng loạt
trên tôm sú nuôi được xác định do ba loại bệnh: bệnh MBV, bệnh đốm trắng và bệnh
đầu vàng (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004).
Từ năm 1996 đến nay, tôm nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa và các địa phương
khác trong cả nước chịu tác hại rất lớn của bệnh đốm trắng. Bệnh này xảy ra hàng
năm, trên diện rộng, có những vụ nuôi 80% diện tích nuôi tôm ở một địa phương bị
thất thu hay thu hoạch sớm ngoài dự kiến (Bộ Thuỷ Sản, 2003).
Năm 2001, Bùi Quang Tề và cộng sự đã điều tra 483 hộ nuôi tôm sú thuộc 23
huyện của 8 tỉnh ven biển phía Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định,
Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh) có 166 hộ (34,3%) có tôm nuôi và tôm cua
tự nhiên đã mang mầm bệnh đốm trắng và có 169 hộ (34,99%) có tôm chết vì bệnh
đốm trắng. Năm 2003, Bùi Quang Tề và cộng sự phân tích bệnh WSSV bằng kỹ thuật
PCR của 145 mẫu tôm sú và tôm chân trắng nuôi ở các tỉnh ven biển miền Bắc (Quảng
Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Thanh Hoá và Hà Tĩnh) và tôm Postlarve (PL) đưa từ
Quảng Nam và Đà Nẵng chuyển ra Bắc. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng
của tôm (PL) đưa từ Đà Nẵng, Quảng Nam là 23,08%; tôm sú nuôi thương phẩm ở các
tỉnh phía Bắc là 26,92%; tôm chân trắng là 13,33% (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh
Tế Thủy Sản, số 4 – 2004).
Theo báo cáo kết quả nuôi trồng thủy sản (NTTS) năm 2003, cả nước có 546.757
ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là
30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi
tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước. Bệnh xảy ra
với tôm chủ yếu là bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh MBV (Monodon Baculovirus),
bệnh do vi khuẩn Vibrio. Kết quả kiểm tra bệnh ở tôm giống nhập về Hải Phòng và
Quảng Ninh trong năm 2003 do Trạm nghiên cứu NTTS nước lợ thực hiện cho thấy tỷ
- WSSV: White Spot Syndrome Virus
- WSBV: White Spot Baculovirus Virus
- WSVD: White Spot Viral Disease
- WSS: White Spot Syndrome
- WSV: White Spot Virus
- SEMBV: Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus Disease
- HHNBV: Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Baculovirus
Hiện nay, WSSV là tên thông dụng của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú
(Lightner D. V, 1996).
Các chủng virus gây bệnh đốm trắng bao gồm:

8
2.3.1.2. Đặc điểm hình thái
Virus dạng hình que, kích thước 120 x 275 mm, có một đuôi phụ ở một đầu, kích
thước 70 x 300 mm.
Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15 – 28 kD. Vỏ bao có hai lớp

Hình 2.3 Virus nhuộm âm ở trong
huyết tƣơng của tôm sú nhiễm bệnh
WSSV, một số thể virus có đuôi.
(vạch kẻ a = 240 nm (theo
Graindorge & Flegel, 1999))

(Nguồn: Bùi Quang Tề, 2003)

Tên virus Kích thước virus Kích thước nhân
Virus Trung Quốc (HHNBV) 120 x 360 nm
Virus tôm Nhật 1 (RVPJ–1) 84 x 226 nm
Virus tôm Nhật 2 (RV-PJ-2) 83 x 276 nm 89 x 201 nm
Virus bệnh đốm trắng
(WSBV)
70 – 150 x 350 – 380 nm 56 – 67 x 330 – 350 nm

Bảng 2.1 Các chủng virus gây bệnh đốm trắng

(Nguồn: Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004)

9
2.3.2. Vật chủ mang mầm bệnh WSSV
Virus gây bệnh đốm trắng phân bố rất rộng ở nhiều vật chủ, virus không chỉ nhiễm
ở một số loài tôm he (Penaeus) nuôi ở Tây bán cầu mà còn xuất hiện rất rộng ở bộ
mười chân (Decapoda) gồm các loài cua và giáp xác khác.
Ở Việt Nam, mầm bệnh WSSV nhiễm trên nhiều loài tôm he nuôi hoặc sống tự
nhiên: tôm sú (P. mondon); tôm thẻ (P. indicus); tôm rảo (Metapenaeus ensis); tôm đất
(M. lysianassa); tôm chân trắng (L. vannamei) nhập vào nuôi ở Việt Nam (Tạp chí
thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004).
2.3.3. Các con đƣờng lây truyền WSSV


2.3.4. Cơ chế xâm nhập
Virus gây hội chứng đốm trắng khi xâm nhập vào tôm sẽ cư trú ở nhiều bộ phận
của tôm như mô nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh,
mắt, chân bơi và các bộ phận khác. Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, virus này tiến
hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và năng lượng của tế bào. Thông qua quá
trình này, số lượng thể virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình
thường của tế bào. Khi quan sát dưới kính hiển vi, các tế bào bị nhiễm virus thường có
nhân phình to. Virus phát triển đến giai đoạn phá vỡ nhân và giết chết tế bào, virus lan
truyền ra môi trường nước, đi tìm ký chủ khác và lại tiếp tục xâm nhập và tấn công
(Trần Thị Việt Ngân, 2002). Ngoài ra, tôm ăn phải virus tự do tồn tại trong bùn ao và
trong nước cũng dẫn đến nhiễm mầm bệnh WSSV (Chou H. Y và ctv., 1996; trích bởi
Trần Thị Hoàng Dung, 2000).
2.3.5. Triệu chứng của bệnh
Dấu hiệu bệnh lý đặc trưng: tôm bị bệnh giảm ăn rõ rệt, mệt mỏi, vỏ bì chùng lỏng
với những đốm trắng từ 0,2 – 2 mm đường kính, biểu hiện ở bề mặt bên trong của vỏ.
Trong nhiều trường hợp, tôm hấp hối do bệnh WSSV chuyển sang màu hồng đến màu
(Nguồn: Trần Thị Việt Ngân, 2002)

2.3.6. Phƣơng pháp chẩn đoán
Kết hợp với dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng đã được mô tả ở Hình 2.5 và
2.6, mầm bệnh đốm trắng có thể phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau (Trần
Thị Minh Tâm, 1999):
- Phương pháp mô học: dấu hiệu định bệnh là sự xuất hiện của những thể vùi trong
nhân tế bào của các mô có nguồn gốc trung bì.
- Phương pháp PCR: dấu hiệu định bệnh là phát hiện sản phẩm khuếch đại của một
đoạn gen đặc hiệu của tác nhân gây bệnh.
- Phương pháp lai tại chỗ ADN (In situ DNA hybridization): dấu hiệu định bệnh là
kết quả lai giữa đoạn gen dùng làm mẫu dò và đoạn gen của tác nhân gây bệnh trong
điều kiện nghiêm ngặt.
Hình 2.5 Tôm sú bị bệnh đốm
trắng dạt vào bờ và chết
Hình 2.6 Vỏ đầu ngực tôm bị
bệnh đốm trắng

(Nguồn: Bùi Quang Tề, 2003) 12
- Phương pháp Dot blot và Southern blot: được thực hiện với sản phẩm khuếch đại
của một đoạn gen đặc trưng của tác nhân.
- Phương pháp miễn dịch huỳnh quang: dấu hiệu định bệnh là kết quả kết hợp đặc
hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.
Trong đó kỹ thuật PCR là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, nhạy, và có tính đặc hiệu cao.
Kỹ thuật này đã được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và phát triển, đồng thời đưa ra
các cải tiến mới như: Nested PCR, Semi – Nested PCR, Real - time PCR,…Với độ

- Primer
- Bốn dNTP (2’– deoxynucleoside – 5’ – triphosphate): dATP, dTTP, dGTP, dCTP
- Taq polymerase
- Dung dịch đệm
- Mg
2+

- Chất phụ trợ (additive): được sử dụng để tăng hiệu quả khuếch đại
2.4.1.3. Các bƣớc phản ứng
Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002), phản ứng PCR gồm các bước:
Bước 1: trong dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao
chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn T
m
của phân tử, thường là ở
94
0
C - 95
0
C trong vòng 30 giây – 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
Bước 2: nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn T
m
của các primer) cho phép các primer
bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40
0
C -
70
0
C, tùy thuộc T
m
của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây – 1 phút. Đây là giai

2.4.1.4. Ứng dụng
PCR được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khoa học đời sống như: chẩn đoán phân
tử và công nghệ di truyền. Trong chẩn đoán phân tử, ứng dụng chủ yếu là phát hiện tác
nhân gây bệnh (Too H. P., 2001).
Đối với ngành Thủy sản, PCR đóng vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán sớm
mầm bệnh trước và trong lúc nuôi, đặc biệt là bệnh đốm trắng.
2.4.1.5. Ƣu và nhƣợc điểm
PCR dễ sử dụng và đưa ra kết quả có độ tin cậy cao. Kỹ thuật này chỉ cần một
lượng mẫu rất nhỏ để xác định mầm bệnh, ngay cả có thể lấy mẫu từ một con tôm nhỏ
để phân tích mà không cần làm chết con tôm. Mặc dù kỹ thuật PCR phát hiện nhanh
với độ nhạy cao nhưng vẫn cần 18 – 36 giờ cho một xét nghiệm. Kỹ thuật này không
có khả năng định lượng chính xác số bản sao của tác nhân cần kiểm tra trong mẫu
bệnh phẩm. Trong những năm qua, kỹ thuật PCR đã phát triển không ngừng thông qua
những cải tiến mới về nguyên lý, thiết bị và hóa chất. Nested và Real - time PCR là hai
cải tiến mới của kỹ thuật PCR. Nested PCR là phương pháp cải thiện độ nhạy của kỹ
thuật PCR. Trong khi đó Real - time PCR cải thiện kỹ thuật PCR cả về độ nhạy và khả
năng định lượng chính xác số bản sao của tác nhân cần kiểm tra (Tạp chí Thủy sản, số
3 – 2004).

1 Biến tính (95
0
C)

2 Bắt cặp (40 -70
0
C)

Nested PCR được thực hiện qua hai bước hay một bước:
- Hai bước: hai cặp primer ở bên ngoài và bên trong được cho vào hỗn hợp PCR ở
từng bước riêng lẻ. Bước 1 nhằm khuếch đại đoạn ADN đích để cho sản phẩm PCR
lần nhất. Bước 2 để khuếch đại đoạn ADN bên trong sản phẩm PCR lần nhất.
- Một bước: hai cặp primer ở bên ngoài và bên trong được cho vào hỗn hợp PCR
cùng lúc để khuếch đại đoạn ADN đích mong muốn.
Trong đề tài này, kỹ thuật Nested PCR một bước được ứng dụng trong chẩn đoán
mầm bệnh WSSV.

PCR lần nhất

PCR lần hai

Hình 2.7 Nguyên tắc của Nested PCR

(Nguồn: Too H. P., 2001) 16
2.4.2.2. Ƣu và nhƣợc điểm
Theo Phạm Hùng Vân (2002), ưu điểm của phương pháp này là:
- Nested PCR có độ nhạy phát hiện vi sinh vật đích rất cao.

, Cy
TM
5,…

17
2.4.3.2. Khái niệm
Real - time PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn ADN
chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang. Trong phản ứng Real - time PCR,
quá trình nhân bản ADN đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp
(Newton C. R. and Graham A., 1997).
Real - time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản ADN bằng phản
ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn ADN tạo thành.
(Nguyễn Thái Thủy, 2003).
2.4.3.3. Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên sự khuếch đại một đoạn ADN đặc hiệu. Sản phẩm khuếch
đại được đánh dấu bằng chất chỉ thị màu hay probe gắn huỳnh quang. Trong khi chạy
Real - time PCR, đầu đọc Real - time sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ở
bước nhiệt độ trong các chu kỳ nhiệt tùy vào mỗi phương pháp phát hiện tín hiệu màu.
Mẫu xét nghiệm chứa nhiều ADN đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện sớm
hơn là mẫu xét nghiệm có ít ADN đích. Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên
phần mềm và biết được nồng độ tác nhân gây bệnh ban đầu của mẫu xét nghiệm dựa
vào các nồng độ ADN chuẩn. Nồng độ ADN trong các mẫu xét nghiệm sẽ được xác
định dựa trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với log số bản
sao ban đầu của các mẫu chuẩn.
2.4.3.4. Hệ thống Real - time PCR
Hệ thống Real - time PCR gồm máy luân nhiệt được nối với máy quang phổ huỳnh
quang và máy vi tính.
2.4.3.5. Phƣơng pháp phát hiện tín hiệu Real - time PCR
Tính đặc hiệu của Real - time PCR tùy thuộc hóa chất dùng để theo dõi phản ứng
khuếch đại và dụng cụ để kiểm tra tín hiệu. Các hóa chất khác nhau dùng trong mục
đích này (Weighardt F., 2004):
- Phẩm nhuộm chèn vào ADN sợi đôi sẽ phát huỳnh quang: ethidium bromide,
SYBR Green I.
- Probe đặc hiệu có gắn chất phát huỳnh quang: TaqMan probe, Fluorescence
Resonance Energy Transfer (FRET) probe, Molecular Beacons probe, Scorpions và
TaqMan Minor Groove Binder (MGB) probe.
Các hóa chất được dùng phổ biến hiện nay trong Real - time PCR như sau:
Hình 2.9 Nguyên tắc hoạt động của hệ thống Real - time PCR
KÍNH LOÏC
KÍCH THÍCH
KÍNH LOÏC
PHAÙT SAÙNG
TIA SAÙNG LEÄCH

ADN đích, đầu 5’ và 3’ tách riêng biệt, tín hiệu huỳnh quang được phát ra tương ứng
với số ADN đích tạo thành (Bio-Rad, 2004).
Ở bước biến tính (95
0
C), Molecular Beacons probe tách nhau hoàn toàn, mở vòng
kẹp tóc, tín hiệu huỳnh quang tăng cao. Khi nhiệt độ giảm xuống ở giai đoạn bắt cặp,
Molecular Beacons probe gắn kết với trình tự ADN đích. Các Molecular Beacons
probe không gắn bổ sung lên trình tự ADN đích sẽ tự bắt cặp lại trở về cấu trúc kẹp tóc

Hình 2.10 SYBR Green I chèn vào ADN sợi đôi

(Nguồn: Weighardt F., 2004) 20
ban đầu. Do vậy, tín hiệu huỳnh quang ghi nhận được ở giai đoạn này hoàn toàn tương
ứng với lượng ADN đích. Đối với Molecular Beacons probe, dữ liệu huỳnh quang
được thu nhận trong giai đoạn bắt cặp (Bio-Rad, 2004).

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) probe
FRET dựa vào sự truyền năng lượng từ fluorophore cho sang fluorophore nhận.
TaqMan probe
TaqMan probe được dùng phổ biến nhất trong các tài liệu về Real - time PCR.
Probe oligonucleotide gắn vào đoạn bên trong ADN đích. Probe này được đánh dấu
ở đầu 5’ bằng chất nhuộm chỉ thị huỳnh quang – fluorescent reporter dye (gọi là
reporter) và chất hấp thụ – quencher ở đầu 3’. Reporter và quencher có phổ kích thích
và phát quang trùng nhau. Nhờ đó tín hiệu huỳnh quang được hấp thu. Khi ADN đích
tích lũy, probe gắn vào ADN đích nhưng chưa phát quang. Khi mạch bổ sung với
mạch khuôn mà probe bắt cặp được kéo dài, Taq ADN polymerase tiến tới đầu 5’ của
probe. Hoạt tính 5’3’ exonuclease của Taq ADN polymerase sẽ phân cắt đầu 5’ đã
được đánh dấu huỳnh quang của probe. Do đó chất chỉ thị huỳnh quang - reporter được
phóng thích ra khỏi sự bắt cặp của chất hấp thụ – quencher và tín hiệu huỳnh quang
tăng lên. Mức độ huỳnh quang tương ứng với số ADN chuyên biệt mong đợi. Khác
với SYBR Green I, primer dimer và các sản phẩm ADN khuếch đại không đặc hiệu sẽ
không cho tín hiệu huỳnh quang (McPherson M. J. và Moller S. G., 2001).
Như vậy, tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận trong giai đoạn kéo dài. Độ mạnh tín
hiệu huỳnh quang tích lũy tăng dần.
Tuy nhiên TaqMan probe cần phải đảm bảo (Nguyễn Thái Thủy, 2003):
- Chất phát huỳnh quang được chọn làm reporter phải có phổ phát sáng tách biệt
với quencher.
- Reporter phát sáng trong khoảng kích thích của quencher.
- Quencher phải nằm gần reporter để hấp thụ hiệu quả.
Trong đề tài này, tôi dùng TaqMan probe để bắt cặp với đoạn đặc hiệu 100 bp cần
khuếch đại nhằm phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú.
TaqMan probe được đánh dấu ở đầu 5’ bằng chất chỉ thị huỳnh quang FAM (đóng vai
trò reporter) và 3’ TAMRA (đóng vai trò quencher). Hình 2. 12 Nguyên tắc của FRET probe
2.4.3.6. Nguyên lý định lƣợng của kỹ thuật Real - time PCR
Để định lượng số bản sao ban đầu của mẫu cần xét nghiệm, khi thực hiện định
lượng qua Real - time PCR cần chạy kèm với các chuẩn đã biết chính xác số bản sao Hình 2.13 Nguyên tắc của TaqMan probe

(Nguồn: Nguyễn Thái Thủy, 2003) 23
ban đầu. Khi phản ứng Real - time PCR kết thúc, giá trị chu kỳ ngưỡng của mẫu xét
nghiệm và của các chuẩn được xác định ở thời điểm có sự tương quan tuyến tính giữa
số chu kỳ và nồng độ huỳnh quang đo được (pha log hay pha cấp số). Tại thời điểm
này, đường baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền) phải cắt tất cả các đường
biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang đo được và số chu kỳ. Tại vị trí cắt
này, tín hiệu huỳnh quang vượt qua tín hiệu nền rõ rệt. Chu kỳ ngưỡng của mẫu và
chuẩn được xác định tại vị trí đó.
Đường chuẩn được hình thành dựa vào chu kỳ ngưỡng (đã được xác định ở trên) và
nồng độ bản sao của các chuẩn đã biết. Chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm được đối
chiếu qua chu kỳ ngưỡng của các chuẩn nằm trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ
giữa log số bản sao ban đầu và chu kỳ ngưỡng. Kết quả đối chiếu này sẽ cho giá trị log
số bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm qua phương trình Y = a.X + b (trục Y: chu kỳ
ngưỡng, trục X: log số bản sao ban đầu). Từ giá trị log số bản sao ban đầu này ta sẽ
quy đổi ra số bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm.
25
Phần 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1. Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện từ ngày 01/ 03/ 05 đến ngày 01/ 08/ 05.