To bào t Bacillus subtilis biu hin streptavidin
gn kháng th biotinyl hóa kháng virus gây bnh
m trng  tôm

Bùi Thu Thy

Tri hc T nhiên, Khoa Sinh hc
LuChuyên ngành: Sinh hc thc nghim; Mã s: 60 42 30
ng dn: TS. Nguyn Th Vân Anh
o v: 2011

Abstract: Tng quan các v cn nghiên cu: bào t Bacillus subtilis và
biu hin protein ngoi lai trên b mt bào t; Streptavidin; Virus gây bnh
m trng  Tôm; Phn  t min dch và ng dng. Gii thiu
nguyên li     u. Trình bày mt s kt qu nghiên
cn gen Streptavidin vào vector PDG364 Cotb và dung hp
vào h gen B -  biu hin protein dung hp Cotb 
Streptavidin trên b mt bào t B -  liên kt ca bào
t - strep vi kháng th kháng VP28-Biotinyl: Phn ng nt min dch
th ng kim tra s có mt ca Virus gây bm trng trên tôm WSSV

Keywords: Sinh hc thc nghim; Bào t; Kháng th; Virus; B m
trng; Tôm

Content
I. Tổng quan
Bào t Bacillus subtilis là mt trong nhng nghiên cc nhiu nhà
khoa hc quan tâm nh tính cht bn nhic hc bi





















. 







 



























 , 



 







t
 c vi các phân t c biotinyl hóa.  Bacillus subtilis 






 (gi tt là bào t-strep) 





 


. Bào t-strep có th c s dt cht mang ng” nh kh n
vi phân t c biotinyl hóa vi nhin nhit, bn vi các tác nhân lý hóa
hng nht c micromet, hy vng s có kh chuyên ch các kháng
nguyên ca vi sinh vt, các enzyme, các kháng th  phc v cho các m
hay ng dng khác nhau.
Virus gây bm trng  tôm (WSSV) là loi virus gây bnh nghiêm trng và ph
bin  tôm nuôi, là nguyên nhân ch yu gây ra nhng tn hi kinh t li vi ngành
công nghip tôm trên toàn th gii. Hit bin pháp cha tr hu hiu nào
i vi bnh bnh do virus WSSV gây ra. Do vy, phát hin sm virus gây b
trò quan trng và then cht trong vic phòng nga b  m trng gây ra. Rt

 Các cp mc hin gen streptavidin, cotB, amyE front/back, VP28
cùng các hóa cht khác dùng cho sinh hc phân t
2.2. Phƣơng pháp:
 Nghiên cu s dng mt s  PCR, x lý enzyme gii hn, bin np,
n di proitein, thm tách min dch, làm phn t
III. KẾT QUẢ
3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN STREPTAVIDIN, COTB VÀO VECTOR PDG364 VÀ
DUNG HỢP VÀO HỆ GEN B. subtilis
3.1.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa cotB và streptavidin bằng phƣơng pháp PCR
Phn ng PCR nhân bn gen streptavidin và cotB vi chu trình nhit cho tng

i vn gen cotB: 94
0
C : 30 giây
65
0
C : 45 giây x 30 chu k
72
0
C : 1 phút
i vn gen streptavidin
94
0
C : 30 giây
65
0
C : 45 giây x 30 chu k
72
0
C : 30 giây

C : 1 phút 40 giây

Hình 2: Kết quả điện di sản phẩm PCR các khuẩn lạc bằng cặp mồi 364 Fw/Rv
Đường chạy 1: Thang chun ADN 1 kb, Đường chạy 2-5: Các khun lc 1-4
2 khun lc (các khun lc 3,4) cho kt qu 
xut hin trên bn di agarose là khong 1,6 kb cho phép chúng tôi có th kt lun
rn gen cotB n thành công vào vector pDG364, to vector tái t hp pDG364
cotB. Khun lc s 3 c nuôi  tách plasmid, chun b c nhân dòng tip theo.
3.1.3. Nhân dòng đoạn gen streptavidin vào vector pDG364 cotB
Phn ng ni streptavidin vào vector pDG 364 cotB c tin hành  gn
gia cotB vi pDG 364. Các khun lc sau quá trình bin nc kim tra bng
i cp mi cn cotB, streptavidin và ca vector pDG364.
Ch  nhit ca phn ng PCR s dng m
94
0
C : 30 giây
56
0
C : 45 giây x 30 chu k
72
0
C : 2 phút 10 giây
Sau khi tin hành phn ng PCR cho 3 khun lc chn ngu nhiên, s dng cp
mi ca vector pDG 364 Fw/Rv, kt qu n di sn phc th hin  hình 3.

Hình 3: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiê
̉
m tra ca
́
c khuâ

p cotB streptavidin
 khnh thêm, chúng tôi tin hành kim tra mt ln na th tái t hc
bt enzyme gii hn. Kt qu n di các sn phm ct plasmid bng
enzyme gii hn (hình 27) cho thy khi plasmid tái t h c ct bi cp HindIII và
Ecoa streptavidin (hình 4c ct bng cp enzyme
BamHI và EcoRI thì xut hin gen dung hp cotB-streptavidin (hình
4a),

(a) (b)
Hình 4: Kết quả điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn của vector tái tổ hợp
pDG364 cotB-streptavidin
(a) Đường chạy 1: Thang chun ADN 1 kb, Đường chạy 2: c x lý vi cp
enzyme BamHI và EcoRI, Đường chạy 3u
(b) Đường chạy 1: Thang chun ADN 1 kb, Đường chạy 2: u, Đường chạy 3:
c x lý vi cp enzyme HindIII và EcoRI






, 





 g co thành công vector tái
t hp pDG 364 cotB streptavidin
3.1.4. Đƣa đoạn gen dung hợp cotB-streptavidin trên vector vào hệ gen B. subtilis

 B. subtilis PY79  i tinh bt ry
các khun lc ki

ng h



 ,
n gen cotB-streptavidin c dung hp vào h gen B. subtilis.

Hình 5: Kiểm tra sự có mặt của gen dung hợp trong ADN hệ gen Bacillus subtilis
A) ch LB mang các khun lc nhum màu Iot
B) 


















VP28-biotinyl vi ng kháng th : 10 µg, 50 µg và 100µg. Bào t B. subtilis
PY79 hoang di c làm  kim tra.

Hình 7: Kiểm tra khả năng gắn của bào tử với kháng thể biotinyl hóa đa dòng
Đường chạy 1: 10
9
bào t B.subtilis PY79  vi 10 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường chạy
2: 10
9
bào t, B.subtilis PY79  vi 50 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 3: 10
9
bào
t B.subtilis PY79  vi 100 µg kháng th kháng VP28 biotinyl ,Đường chạy 4: Thang chun
protein nhum sn,Đường chạy 5: 10
9
bào t-strep  vi 100 µg kháng th kháng VP28 biotinyl,
Đường chạy 6: 10
9
bào t-strep  vi 50 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 7: 10
9
bào
t-strep  vi 10 µg kháng th kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 8: 1 µg kháng th kháng VP28
biotinyl
Kt qu c trên hình 7 cho thy, khi gn kháng th i bào t, chúng
   kDa  các mu bào t-strep ca kháng th kháng VP28 (ng
chy 5-7 m nht cc t l thun vi n kháng th cho vào.
i vi mu bào t B. subtilis PY79 hoang dng chy 1-3)
c  -strep  tt c ng kháng thu này có th c lí
gii do trong quá trình thao tác, kháng th kháng VP28 liên k c hiu vi các
protein  lp áo ngoài ca bào t . T kt qu này, chúng tôi có th bc u kt lun bào

ngoài ca bào t B. subtilis PY79 vi kháng th là không bn vng và không phi là liên
kc hiu. Ngoài ra, vi 10 µg kháng th c s dng cho phn ng gn vi bào t-strep
thì liên kt gia streptavidin vi kháng th c bn v
dng kháng th là 50 µg và 100 µg. T kt qu c, chúng tôi có th khng
nh bào t-strep có kh c hiu và bn vng vi kháng th 
VP28-  chúng tôi phát trit min dch
ng dng trong phát hin virus gây bm trng trên tôm WSSV.
3.3.1. Đánh giá mức độ liên kết của bào tử-strep với kháng thể đơn dòng kháng VP28-
biotinyl
Trong thí nghing kháng th  dng cho phn ng là
50 µg và 100 µg.

Hình 9: Kiểm tra khả năng gắn của bào tử với kháng thể biotinyl hóa đa dòng
Đường chạy 1: Thang chun protein nhum sn, Đường chạy 2: 10
9
bào t-strep  vi 50 µg kháng
th Đường chạy 3: 10
9
bào t-strep  vi 100 µg kháng th 
dòng kháng VP28 biotinyl, Đường chạy 4: 1µg kháng th 
Hình 9 cho thy bào t-st n vi kháng th 
VP28-biotinyl  c y, bào t-strep gn vi kháng th kháng VP28-
biotinyl c u có th s dng cho phn t
sau này.
3.3.2. Đánh giá hằng số phân ly của phức hệ bào tử-strep- kháng thể kháng VP28-
biotinyl
N  ca kháng th kháng VP28-biotinyl gn lên bào t- c tính toán
bng phn mm Scion image d sáng c
1µg kháng th kháng VP28-biotinyl chun. Da trên ma n kháng
th phn u và n kháng th gn lên bào t-strep, chúng tôi có th tính toán

= R
S
x C thì [S]= m
2
- y
Và m
o
là n kháng th u thì [A] = m
o
-y
Kt hp vi s liu tính toán bng phn mc  trên, chúng tôi
s dng phn m dng chun da 
trên phù hp vi s liu thc nghim. T ng chun (v tin cy R= 0,98), chúng tôi
c giá tr K
b(C-S)
ng kháng th kháng VP28-biotinyl hp ph trên mi bào t,
c th là:
 K
bSA
=1/m
1
= 1/3500 = 0.0028 (nM) = 2,8x10
5
/M
 R
S
xC = m
2
= 64 (nM)
Vi n  ca 10

virus trong tng n 
Bảng 3: Số bản copies trong từng dung dịch WSSV
N pha loãng
S bn copies/50µl
S bn copies/1ml
u
3,8x10
4
copies
76x10
4
copies
WSSV 1:4
4,3x10
3
copies
87x10
3
copies
WSSV 1:16
-
-
WSSV 1:64
-
-
(-): không thể xác định
Vi hai n pha loãng 1:16 và 1: 64, Realtime PCR không th c s
b  khui.
3.4.2. Đánh giá khả năng hình thành ngƣng kết giữa bào tử-strep gắn kháng thể đa
dòng kháng VP28-biotinyl với dịch nghiền tôm nhiễm WSSV

hình thành nên mi kháng nguyên-kháng th. Do vy, phn t không xy
c. Ngoài ra, vng th tích dch nghi
khó có th kic phn t có xng th tích quá
lni kt qu này, chúng tôi quynh chn th tích dch
nghin là 50 µl cho toàn b thí nghing thi, phn t xy ra vi
bào t-strep gn 10 µg, 50 µg và 100 µg kháng th biotinyl hóa. Tuy nhiên, kt hp vi kt
qu western blot  m  m bo liên kt gia bào t-strep vi kháng th kháng
VP28-biotinyl bn vng, n kháng th c chn cho các thí nghim sau này là 50 µg.
3.4.3. Đánh giá khả năng hình thành phản ứng ngƣng kết giữa bào tử-strep gắn kháng
thể kháng VP28-biotinyl với các nồng độ virus pha loãng
Vi nhng kt qu u, chúng tôi tip tc tin hành thí nghi xác
c n virus ti thi s t có th xy ra. Chúng tôi tin hành thí
nghim vi các dch nghic pha loãng theo các t l 1:4, 1:16 và 1:64 và xác
nh s bn copies ca WSSV.
3.4.3.1. Phản ứng ngưng kết giữa bào tử-strep gắn kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl
với các nồng độ virus pha loãng
Trong thí nghim này, 50 µl dch virus vi các n c  vi bào t-
strep có gn kháng th -biotinyl n 50 µg. Hn hc  
nhi phòng trong 4 gi. Hình 11 là s t theo thi gian.

Hình 11: Phản ứng ngƣng kết giữa bào tử-strep-kháng thể đa dòng kháng
VP28-biotinyl với các nồng độ WSSV pha loãng
Giếng Ai chng (-m NTE, Giếng B: Dch nghin virus n u, Giếng C: Dch
nghic pha loãng 1:4, Giếng D: Dch nghic pha loãng 1:16, Giếng E: Dch
nghic pha loãng 1:64, Giếng F: i chng (-) Dch nghin tôm không nhim WSSV
Kt qu trên hình 41 cho thy, sau 3 gi   nhi phòng, s u
xut hin  ging phn ng s 2 (cha dung dch WSSV n gc li trong các
gii chng âm (ging s 1 và 6) và các ging cha dung dch virus pha loãng 4 ln, 16
ln và 64 ln thì bào t-strep bu tp trung li  ng. S khác bic th
hi c bit rõ nét là  gi th 4. y, phn t ch xut

Vi nhng kt qu c trong quá trình nghiên c
t s kt lun sau:
1. Nhân dòng thành công gen streptavidin vào vector pDG364 cotB và dung hp
n gen cotB-streptavidin vào ADN h gen Bacillus subtilis.
2. Biu hin thành công protein dung hp cotB-streptavidin trên b mt bào t
Bacillus subtilis.
3. Bào t-n kc hiu và bn vng vi kháng th 
c biotinyl hóa.
4.  u ng d c bào t-strep gn kháng th kháng VP28-biotinyl 
phát hin s có mt ca virus gây b m trng nh phn   t.
   n s có mt ca virus gây b m trng vi
n ti thiu là 3,8x10
4
bn copies, thng 10 ln so v
pháp PCR.
HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
Tip tc nghiên c tu kin phn  gim thi
gian ca phn t xu nhy ca phn ng và
hn ch s xut hin ca kt qu .

References
I. TÀI LIỆU TRONG NƢỚC
1. Nguyn, PhGiáo trình Vi sinh
vật học, NXB Giáo dc, Hà Ni.
2.  Ngc Liên (2008), Miễn dịch học cơ sởi hc Quc gia Hà Ni.
3. Ph Ty (2001), Miễn dich họci hc Quc gia Hà Ni.
II. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI
4. Argarana, C., Kuntz, I.D., Birken, S., Axel, R., Cantor,   
Oxf. J., 14, pp. 1871-1882.
5. Chaiet, L., Wolf, F.J. (1964) The Properties of streptavidin, a biotin-binding protein

17. Takekazu, O., Fumiko, N., Shuta, Y., Keisuke, Y., Norihisa, O., Kiyoshi, L., Hiroshi,
O., Haruji,           
homogenate of the kuruma shrimp (Penaeus japonicus) by reverse passive latex
J. Virol. Methods, 119, pp. 1116.
18. Takekazu, O., Fumiko, N., Shuta, Y., Keisuke, Y., Norihisa, O., Kiyoshi, L., Hiroshi,
O., Haruji, S. (2005), Detection of white spot syndrome virus (WSSV) from hemolymph of
Penaeid shrimps Penaeus japonicus by reverse passive latex agglutination assay using high-
density latex particles, J. Virol. Methods, 124, pp. 143148.
19. Valimaa, L. (2008), Streptavidin- A versatile binding protein for solid-phase
immunoassays, University of Turku, Finland.
20. Witteveldt, J., Cifuentes Carolina, C., Vlak Just, Penaeus
monodon J. Virology, pp. 2057-
2061.
21. Wu, S., Wong,       
reversible biotin J. Biol. Chem., 280, pp. 23225-23231.
22. http://www.astrobio.net/exclusive/3184/wanted-easy-going-martian-roommates
23. http://classes.midlandstech.com/carterp/courses/bio225/chap10/lecture3.htm
24. http://en.wikipedia.org/wiki/Biotin
25. http://extramarks.com/ask-exploreanswer/question/45525/science/what-is- endospore-
formation-expain-it/8/?pn=&prevsh=
26. http://faculty.washington.edu/stenkamp/stefanieweb/hydro.htm
27. http://faculty.washington.edu/stenkamp/stefanieweb/loops.html
28. http://faculty.washington.edu/stenkamp/stefanieweb/trypto.html
29. http://research.ncku.edu.tw/re/articles/e/20110916/3.html
30. http://sciencefilm.de/detail.php?id=215017&rubrik=Bio&lang=en&q=&qrubrik=
31. http://sonongnghiephatinh.gov.vn/vn/Recommendd.aspx?tabid=58
32. http://www.tansaoa.comdoc_viewer.aspxfileNameuploadfiledomtrang.pdf